背景及概述^[1]

寡核苷酸藥物 (oligonucleotides, ONs) 是由人工化學合成的 12～30 個核糖寡核苷酸單鏈或雙鏈組成的一類藥物, 通過 Watson-Crick 堿基配對原則作用于目標信使 RNA (mRNA) 主要分為反義寡核苷酸藥物 (antisense oligonucleotides, ASOs) 和小干擾RNA藥物 (small interference RNA, siRNA) 兩大類。

雖然人工合成寡核苷酸調節(jié)靶向基因表達的概念在 40 年前就被提出, 但是因為核酸的藥動學成藥性差、脫靶毒性、遞藥系統(tǒng)等技術瓶頸沒有解決, 主要用于細胞或動物科研實驗中的基因敲除。隨著過去20年化學和生物技術的發(fā)展, 一些關鍵技術難題被攻克,全球迎來核酸類藥物研發(fā)熱潮。2016至 2019短短 3年間, 美國 FDA 就批準了 4個反義寡核苷酸類藥物 (Defibrotide、Eteplirsen、Nusinersenand和 Inotersen) 和 2個 siRNA 藥物 (Patisiran、Gi‐vosiran), 其調節(jié)轉錄翻譯的機制引起制藥行業(yè)關注。一些罕見、疑難疾病, 如遺傳性轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性、杜氏肌萎縮癥、乙型肝炎等仍然不能得到有效治愈, 核酸類藥物通過基因敲除或者剪接調控機制有望填補小分子藥物和單克隆抗體藥物的空白治療領域。目前全球有50多個寡核苷酸藥物處于不同的臨床研究階段, 覆蓋罕見病、難治愈疾病多個治療領域。中國寡核苷酸藥物的研發(fā)公司多處于起步階段,主要集中在昆山小核酸產業(yè)基地。

成藥性改造面臨的挑戰(zhàn)^[1]

1 化學修飾

未經化學修飾的寡核苷酸藥物成藥性通常不理想。它們具有較差的 PK 特性, 比如穩(wěn)定性差, 易被核酸酶降解; 極性大, 很難進入細胞, 分布特性差; 對目標 mRNA的結合親和力不佳。為了達到臨床效用, 寡核苷酸必須經過化學改造 (圖 1)。

目前廣為使用的結構改造的基礎骨架是磷硫 (PS) 修飾, 即將非橋接的磷酸二酯氧替換成硫原子。PS 骨架的修飾減少了寡核苷酸的親水性、增加了對核酸酶降解的抵抗力以及增加了其與血漿蛋白結合 進而使得寡核酸穩(wěn)定性增加, 減少腎小球濾過到尿液中排泄。PS骨架的改造雖然改善了部分PK特性, 使其系統(tǒng)暴露增加進而增加細胞攝取和轉運, 但是單一的PS骨架修飾不能保障寡核苷酸不被酶降解, 并且在高濃度時這種修飾降低了寡核苷酸和靶標的親和力, 使機體產生炎癥反應。為了進一步增加靶標結合親和力、抵抗核酸酶降解、減少促炎癥反應, 在20世紀90年代出現(xiàn)了具有糖基修飾的二代寡核苷酸藥物二代寡核苷酸是在 PS 骨架修飾的基礎上將2′-羥基 (2′-hydroxyl, 2′-OH) 替換成2′-甲氧基 (2′-O-methyl, 2′-O-Me)、2′-甲氧乙氧基 (2′-Omethoxyethyl, 2′-MOE)、2′-氟 (2′-fluoro, 2′-F) 或者引入構象約束結構, 比如鎖核酸 (locked nucleic acid, LNA)以及它的甲基化衍生物即約束乙基 (constrained ethyl,cEt)。2′-F或者2′-O-Me 20世紀60年代就合成了, 但是30年后才應用到臨床治療中。2′-O-Me的修飾提高了靶標親和力、核酸酶降解的抵抗力以及減弱 PS 骨架引起的免疫刺激性，在 2′-O-Me 基礎上, 2′-MOE可以進一步增加靶標結合親和力和抵抗核酸酶降解。而相對于 2′-MOE, LNA、cEt 結構降低了構象靈活性,與靶標親和性增加了5～10倍然而LNA和cEt報道和肝毒性有關, 這種肝毒性可能由脫靶降解不匹配的RNA造成。目前仍在探索其他的結構化學改造方式, 2′-MOE在反義寡核苷酸藥物中應用最多。上市的Mipomersen、Nusinersen 和 Inotersen 均是這種化學修飾, 同時還有 20 多個同類藥處于臨床不同研究階段。但是對于 siRNA 而言, 2′-MOE 改造應用有限, siRNA廣泛應用 2′-F 或者 2′-O-Me, 如上市的 Patisiran, 同時應用了2′-F和2′-O-Me修飾。

2 細胞內遞送

單克隆抗體藥物通常和細胞外的可溶性靶標或者細胞表面的靶標結合發(fā)揮治療作用, 而寡核苷酸藥物必須進入細胞才能產生藥理活性。和小分子相比, 寡核苷酸藥物的分子質量較大 (6～14 kDa), 高度帶負電,親水性高, 不易透過脂質雙分子層和血腦屏障。沒有遞送系統(tǒng)的ASOs (～7 kDa), 大多數(shù)通過網(wǎng)格蛋白或者小窩蛋白介導的胞飲作用攝取進細胞。寡核苷酸的細胞內化分為“有效途徑”和“無效途徑”“有效途徑”有依賴于非巨胞飲作用和內含體的細胞內分布, 寡核苷酸從內含體逃逸出來, 進入細胞質或細胞核內發(fā)揮藥理作用, 而“無效途徑”也就是巨胞飲途徑, 導致寡核苷酸聚集在溶酶體中被降解或清除出細胞。在內含體中有很多和先天免疫相關的Toll樣受體 (Toll like receptors, TLRs), 當TLRs識別進入內含體的 ONs可能會引起干擾素和其他細胞因子的激活。這個問題在代核酸類藥物中比較常見, 第二代核酸經過核糖骨架的 2′-O-甲基等修飾很大程度上解決了這個問題。

和分子質量～7kDa的ASOs相比, 分子質量～14 kDa的雙鏈siRNA因為較大分子體積和親水性, 經細胞攝取有限。為了增加細胞攝取, siRNA通常連接靶向配體, 比如N-乙酰半乳糖胺 (N-acetylgalactosamine, GalNAc)包裹在脂質納米粒中。

參考文獻

[1]湯仙閣,關曉多,陳銳,胡蓓.寡核苷酸藥物的臨床藥理學研究進展[J].藥學學報,2020,55(02):218-225.