背景^[1-3]

蛋白激酶A(抗體)是一類可以特異性結(jié)合蛋白激酶A的多克隆抗體。主要用于體外檢測(cè)蛋白激酶A的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。

蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）又稱依賴于cAMP的蛋白激酶A（cyclic-AMP dependent protein kinase A），是一種結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單、生化特性最清楚的蛋白激酶。

PKA全酶分子是由四個(gè)亞基組成的四聚體，其中兩個(gè)是調(diào)節(jié)亞基（regulatory subunit，簡(jiǎn)稱R亞基），另兩個(gè)是催化亞基（catalytic subunit，簡(jiǎn)稱C亞基）。R亞基的相對(duì)分子質(zhì)量為49～55kDa，C亞基的相對(duì)分子質(zhì)量為40kDa，總相對(duì)分子質(zhì)量約為180kDa；全酶沒有活性。在大多數(shù)哺乳類細(xì)胞中，至少有兩類蛋白激酶A，一類存在于胞質(zhì)溶膠，另一類結(jié)合在質(zhì)膜、核膜和微管上。

蛋白激酶A

PKA全酶以四聚體形式存在，但PKA被靶向到特定組分時(shí)，也會(huì)在細(xì)胞中形成更高階的結(jié)構(gòu)。經(jīng)典的PKA全酶結(jié)構(gòu)由兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基（R亞基）和兩個(gè)催化亞基（C亞基）組成。催化亞基包含活性位點(diǎn)、在結(jié)合和水解ATP的蛋白激酶中發(fā)現(xiàn)的一系列典型殘基以及結(jié)合調(diào)節(jié)亞基的結(jié)構(gòu)域。調(diào)節(jié)亞基具有結(jié)合到cAMP的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與催化亞基和自身抑制結(jié)構(gòu)域相互作用。調(diào)節(jié)亞基有兩種主要形式：RI和RII。

蛋白激酶A是一組結(jié)構(gòu)多樣的蛋白質(zhì)，具有與蛋白激酶A（pka）的調(diào)節(jié)亞單位結(jié)合和將全酶限制在細(xì)胞內(nèi)離散位置的共同功能。AKAP6是AKAP家族的成員。在不同的腦區(qū)、心臟和骨骼肌中高度表達(dá)。特異性定位于肌漿網(wǎng)和核膜，參與將pka錨定到核膜或肌漿網(wǎng)。

應(yīng)用^[4][5]

用于蛋白激酶A（PKA）在血小板凋亡中的作用研究

探究蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）在血小板凋亡中所發(fā)揮的作用。

方法：采集健康志愿者空腹靜脈全血,分離得到洗滌血小板及富含血小板血漿（Platelet rich plasma,PRP）,調(diào)整血小板的濃度至3×108/ml。人的洗滌血小板與不同濃度的PKA抑制劑H89或?qū)φ斩谆鶃嗧浚―imethyl sulfoxide,DMSO）于22℃孵育160min,利用Western blot檢測(cè)血小板PKA底物GPIbβ（Ser166）的磷酸化程度,用電子顯微鏡觀察血小板的形態(tài)改變。

人的洗滌血小板與H89（37.5μM）或?qū)φ誅MSO于22℃孵育不同的時(shí)間,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板線粒體跨膜電位（Mitochondrial inner transmembrane potential,ΔΨm）變化和磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）外翻程度。

洗滌血小板與不同濃度的PKA激活劑Forskolin或陰性對(duì)照（DMSO）在室溫下孵育10min,然后用ABT737（1μM）在37℃條件下處理90min,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板ΔΨm和PS外翻的變化。

采集6-8周三種PKA(PKA+/+、PKA+/-、PKA-/-)基因型小鼠下腔靜脈全血,分別檢測(cè)血小板的數(shù)量,PKA蛋白的表達(dá)情況和PKA底物GPIbβ的磷酸化程度,并且檢測(cè)血小板ΔΨm去極化程度。

給野生型ICR小鼠注射PKA的抑制劑Rp-c AMPS,之后使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)小鼠體內(nèi)血小板數(shù)量。從糖尿病患者和正常人全血中分別分離血小板和富含血小板血漿（Platelet rich plasma,PRP）,使用Western blot檢測(cè)血小板中PKA底物GPIbβ的磷酸化程度,用ELISA法檢測(cè)血小板中PKA的活性,并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板ΔΨm和PS外翻的變化。

利用ELISA法檢測(cè)糖尿病患者和正常人血漿中凝血酶產(chǎn)生的情況。在體外分別用Forskolin和不同濃度的凝血酶處理血小板,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板ΔΨm和PS外翻的變化。

參考文獻(xiàn)

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