背景及概述^[1]

降纖酶是從長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒中提純的、具有單一成分的蛋白水解酶。能夠抑制血小板聚集，降低血管阻力，增強(qiáng)紅細(xì)胞變形能力，改善微循環(huán)。臨床上用于治療急性腦梗死、不穩(wěn)定型心絞痛、靜脈血栓、高粘血癥等取得了較好的療效。降纖酶可誘發(fā)組織纖維蛋白溶酶原激活劑(t-PA)釋放，并可增強(qiáng)t-PA促進(jìn)纖維蛋白酶生成。降低α2纖溶酶原抑制物和纖維蛋白溶酶原激活劑抑制物的活性。增強(qiáng)活性纖維蛋白溶酶活性，降解纖維蛋白原，縮短優(yōu)球蛋白的溶解時(shí)間。還具有降低全血粘度，抑制紅細(xì)胞沉降，增強(qiáng)紅細(xì)胞血管通透性及變形能力，降低血管阻力，抑制血栓形成等作用。。

生化性質(zhì)^[2]

國(guó)內(nèi)從上世紀(jì)80年代起就開始了對(duì)蛇毒類凝血酶的研究。隨著蛇毒類凝血酶臨床應(yīng)用及研究?jī)r(jià)值的明朗化，對(duì)尖吻腹蛇和長(zhǎng)白白眉腹蛇蛇毒中類凝血酶的理化及酶學(xué)性質(zhì)也進(jìn)行了很多的研究。各種研究表明，尖吻腹蛇和白眉腹蛇都是TLE含量比較豐富的蛇種，其中尖吻腹蛇蛇毒中含有數(shù)種具有類凝血酶作用的同功酶。文獻(xiàn)報(bào)道其分子量及等電點(diǎn)也不盡相同，造成這一現(xiàn)象的原因一方面可能是文獻(xiàn)報(bào)道的分子量都是采用SDS-PAGE測(cè)定的，樣品純度的不一致及測(cè)定本身的誤差導(dǎo)致的，另一方面也可能是不同地理環(huán)境及攝取食物的變化引起的生物差異如糖基化程度的不同導(dǎo)致的。

降纖酶是一種典型的類凝血酶，是以絲氨酸為活性中心的蛋白水解酶，能高選擇性的作用于血纖蛋白原，但其對(duì)血纖蛋白原的作用比凝血酶更為專一。凝血酶能先使血纖蛋白原α鏈N端16肽(FPA)裂解，從而使血纖蛋白首尾相連，接著再使β鏈N端14肽(FPB)裂解，血纖蛋白就進(jìn)一步側(cè)向聚合，體內(nèi)凝血因子ⅩⅢ再使血纖蛋白分子間以肽鍵的形式交聯(lián)，從而形成不可溶的血纖蛋白。而大多數(shù)蛇毒類凝血酶只作用于血纖蛋白原的一條鏈，僅有少數(shù)蛇毒類凝血酶能對(duì)兩條鏈起作用。根據(jù)其對(duì)血纖蛋白原的作用方式可分為FPA型、FPB型和FPAB型。兩種原料來源的降纖酶的酶學(xué)特征相似，它們都是典型的FPA型類凝血酶，具有FPA型類凝血酶的典型酶學(xué)特征：直接作用于纖維蛋白原α鏈N端的Arg16-Gly

鍵釋放出血纖肽A(FPA)，生成非交聯(lián)的纖維蛋白；不激活凝血因子Ⅱ，Ⅴ，Ⅶ，Ⅷ，Ⅸ，Ⅹ，Ⅺ，?，ⅩⅢ；生成的纖維蛋白為可溶性的非交聯(lián)單體；同時(shí)蛇毒類凝血酶能激活纖溶酶系統(tǒng)，因生成的纖維蛋白很快被清除；除了對(duì)纖維蛋白原的作用外，降纖酶還具有水解對(duì)甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯(TAME)和N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)的活力，它的酶活力能被二異丙基氟磷酸(DFP)抑制，這也顯示了其作為一種絲氨酸蛋白酶的本質(zhì)。此外，與凝血酶不同的是，降纖酶不受肝素、抗凝血酶Ⅲ的影響，對(duì)于胰蛋白酶及凝血活性中心His的專一抑制劑甲苯磺酰氯甲酮(TLCK)以及金屬蛋白酶抑制劑二乙胺基四乙酸(EDTA)無影響。對(duì)熱比較穩(wěn)定，早期的研究表明尖吻蝮蛇毒在60℃，pH值7.8的條件下加熱10min，其類凝血酶樣作用僅下降約10%。亦有文獻(xiàn)報(bào)道，來自于尖吻腹蛇的降纖酶有微弱的促血小板凝集作用，其作用的強(qiáng)度約為凝血酶的萬分之一。

降纖酶的結(jié)構(gòu)研究^[2]

降纖酶結(jié)構(gòu)的研究對(duì)于了解其對(duì)底物的選擇性、結(jié)構(gòu)與生物活性之間的關(guān)系以及利用基因重組技術(shù)進(jìn)行表達(dá)等諸多研究領(lǐng)域具有關(guān)鍵意義?，F(xiàn)階段，降纖酶結(jié)構(gòu)研究包括氨基酸序列的測(cè)定、二硫鍵位置及糖基化位點(diǎn)的確定、酶活性中心的推定及高級(jí)結(jié)構(gòu)的模擬等。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的兩種用于生產(chǎn)注射用降纖酶的原料來源尖吻腹蛇Agkistrodonacutus和長(zhǎng)白山白眉蝮蛇中降纖酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。1997年，1999年，從尖吻腹蛇Agkistrodonacutus毒腺中制備總RNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后雙向測(cè)序，并推導(dǎo)出其中尖吻腹蛇降纖酶acutin的相應(yīng)的氨基酸順序。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明acutin由233個(gè)氨基酸組成并且其氨基酸序列與腹亞科蛇毒類凝血酶的序列結(jié)構(gòu)具有高度的同源性，基于同源性推導(dǎo)出其活性中心為His41，Asp84和Ser179，六對(duì)二硫鍵為：Cys7-Cys139，Cys26-Cys42，Cys74-Cys231，Cys118-Cys185，Cys150-Cys164，Cys175-Cys200。2002年報(bào)道了通過RT-PCR反應(yīng)，從長(zhǎng)白山白眉蝮蛇(Agkistrodonhalysussurensis)毒腺總RNA中克隆得到長(zhǎng)白山白眉蝮蛇降纖酶gussurobin的cDNA，雙向測(cè)序得到gussurobin基因的全序列并由此推測(cè)出相應(yīng)的氨基酸序列?；谕葱酝茖?dǎo)出活性中心為His67，Asp112，Asp200和Ser206，六對(duì)二硫鍵為：Cys31-Cys165，Cys52-Cys65，Cys100-Cys258，Cys144-Cys212，Cys176-Cys191，Cys202-Cys237。與其他絕大多數(shù)類凝血酶一樣，降纖酶是一種糖蛋白。有許多研究表明，糖蛋白中的糖基對(duì)其生物活性的保持、分子間識(shí)別及穩(wěn)定性、抗原性具有重要影響。但迄今為止，對(duì)各種類凝血酶包括國(guó)產(chǎn)降纖酶的糖基部分的研究?jī)H限于糖基化程度的確定及可能糖基化位點(diǎn)的推測(cè)。對(duì)其糖鏈部分的結(jié)構(gòu)與作用的研究尚未見報(bào)道。

制劑規(guī)格與pH值^[3]

注射液：2mL∶20u；粉針劑：每支5u，10u。pH：4.8～6。

藥理作用及應(yīng)用^[3]

為我國(guó)長(zhǎng)白山白眉蝮蛇或尖吻蝮蛇的毒液分離出的絲氨酸蛋白酶(SerineProtease)，此酶可降低血漿中的凝血因子Ⅰ的含量、抗血小板聚集與降低血液黏滯度，雖可使凝血因子Ⅰ的α鏈釋放A纖維蛋白肽，但此肽很容易被酶水解而清除，而凝血因子Ⅰ降低是抗凝的主要效應(yīng)；降纖酶還使纖酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，使血液黏滯度下降，抑制紅細(xì)胞與血小板聚集，改善微循環(huán)，并使血栓溶解。臨床用于治療血栓閉塞型脈管炎、動(dòng)脈栓塞、腦栓塞、一過性腦缺血發(fā)作(TIA)，心絞痛與心肌梗死的防治，消除血液高凝、高黏滯狀態(tài)。對(duì)內(nèi)耳血循環(huán)障礙引起的突發(fā)性耳聾亦有療效。

用法用量^[3]

本品僅供靜滴給藥。成人量：急性期一日1次，每次10u，共3～4d；非急性期首劑10u，以后5～10u，24～48h1次，14d為1個(gè)療程。

適宜溶劑^[3]

0.9%氯化鈉注射液250～500mL。

給藥速度^[3]

10u/250mL在60～90min滴完。滴速過快可致心悸。胸痛。

穩(wěn)定性^[3]

注射液在5℃以下保存，勿冷凍；粉針劑在10℃以下保存，避光，密封。靜滴溶液配制后即時(shí)使用，勿在室溫下久置，以免活性降低。

不良反應(yīng)^[3]

過敏性反應(yīng)如瘙癢、蕁麻疹、惡寒或發(fā)熱甚至休克，出血反應(yīng)可見瘀斑、鼻出血、牙齦出血，較輕微反應(yīng)有頭暈、頭痛、一過性轉(zhuǎn)氨酶升高。

禁忌/慎用證^[3]

對(duì)本品過敏、肝腎功能嚴(yán)重不全、心源性休克、心臟乳頭肌斷裂、心室中隔穿孔、多臟器功能衰竭、出血傾向、出血病史、術(shù)后傷口未完全愈合者禁用。70歲以上老年人、腦血栓后遺癥、過敏性體質(zhì)者慎用。用藥期間暫停哺乳。潰瘍病患者、孕婦及兒童慎用。

藥物相互作用^[3]

與抗凝藥、阿司匹林等非甾體鎮(zhèn)痛藥合用可加劇出血風(fēng)險(xiǎn)；抗纖溶藥如氨基己酸、氨甲苯酸、止血環(huán)酸等拮抗本品的作用，不應(yīng)合用。

注意事項(xiàng)^[3]

①發(fā)生過敏、出血時(shí)立即停藥處理。②用藥期間避免做深部穿刺與手術(shù)。③對(duì)用藥者進(jìn)行凝血因子Ⅰ及出、凝血功能檢查，控制抗凝強(qiáng)度。

制備^[2]

蛇毒粗毒中成分非常復(fù)雜，除類凝血酶外還含有神經(jīng)毒素、細(xì)胞毒素、肌肉毒素等許多活性成分，現(xiàn)行降纖酶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求降纖酶產(chǎn)品純度達(dá)到SDS-PAGE電泳純，HPLC測(cè)定純度需大于90%。天然蛇毒中的類凝血酶絕大多數(shù)為酸性蛋白質(zhì)，經(jīng)典的蛋白質(zhì)提純方法如鹽析、熱變性、酸堿變性、有機(jī)溶劑沉淀、超速離心等，由于專一性差和分辨率不高，已很少用于降纖酶的制備。只有少數(shù)的生產(chǎn)工藝會(huì)采用沉淀法作為初步分離的一種手段。從蛇毒粗毒中制備高純度的類凝血酶，現(xiàn)在主要是以各種色譜分離技術(shù)為主。多采用陰離子交換柱進(jìn)行分離，并結(jié)合凝膠過濾、親和層析和反相液相色譜等方法純化。常用的陰離子交換劑有：DEAE-葡聚糖凝膠、DEAE-纖維素、肝素-葡聚糖凝膠等。葡聚糖凝膠多用G-100，G-75作分離。從國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)來看，早期提純降纖酶的方法大多用DEAE Sephadex離子交換層析加上凝膠過濾法，要得到純度符合要求的單組分降纖酶一般都需要多步層析和過濾。近年來，隨著親和層析技術(shù)的發(fā)展成熟，作為一種高選擇性的分離純化技術(shù)，已被普遍地應(yīng)用于蛇毒中降纖酶的分離與純化。親和層析用于從天然蛇毒中分離純化降纖酶，主要運(yùn)用的是酶與爭(zhēng)劑特異性相互作用的原理。降纖酶的抑制劑有很多種，原則上說，這些抑制劑都可以作為特異性配基用于親和層析。用胰蛋白酶的抑制劑Benzamidine作為類凝血酶的抑制劑，成功地將小分子物質(zhì)用于親和分離蛇島蝮蛇毒類凝血酶，為類凝血酶親和層析介質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和研究摸索了新的途徑?？偟恼f來，由于蛇毒粗毒中成分極其復(fù)雜，在降纖酶的實(shí)際生產(chǎn)制備中，大多數(shù)廠家均采用離子交換，凝膠過濾及親和層析相互結(jié)合的分離純化技術(shù)。就技術(shù)而言，分離得到純度99.0%以上的高純度降纖酶已不再是工藝難題。

主要參考資料

[1] 降纖酶的藥理作用和臨床應(yīng)用

[2] 降纖酶研究進(jìn)展

[3] 452種注射劑安全應(yīng)用與配伍