80619-01-8
中文名稱
膽紅素氧化酶
英文名稱
BILIRUBIN OXIDASE
CAS
80619-01-8
分子式
N/A
更新日期
2024/10/29 09:28:01
80619-01-8 結(jié)構(gòu)式
基本信息
中文別名
膽紅素氧化酶膽紅素氧化酶/BOD
膽紅素氧化酶, 10 單位/每毫克蛋白
膽紅素氧化酶, ≥ 50U/MG PROTEIN
BILIRUBIN OXIDASE 膽紅素氧化酶
英文別名
C:C&B9EC 1.3.3.5
Biliruin Oxidase
BILIRUBIN OXIDASE
Oxidase, bilirubin
Bilirubin oxidase M-1
Bilirubin oxidase Amano 3
Bilirubin Oxidase [≥50 units/mg]
BILIRUBIN: OXYGEN OXIDOREDUCTASE
Bilirubin Oxidase [>=10 units/mg]
安全數(shù)據(jù)
警示詞危險(xiǎn)
危險(xiǎn)性描述H334
防范說(shuō)明P261-P285-P304+P341-P342+P311-P501
WGK Germany3
海關(guān)編碼35079090
常見(jiàn)問(wèn)題列表
背景介紹
膽紅素是動(dòng)物體內(nèi)含鐵卟啉化合物進(jìn)行正常分解代謝的產(chǎn)物,是鐵葉琳化合物在人體內(nèi)代謝產(chǎn)物之一。膽紅素在體內(nèi)起著重要的作用,它是一種抗氧化劑,有助于肝細(xì)胞的再生。但是,一旦出現(xiàn)代謝異常,膽紅素就會(huì)在體內(nèi)積累,形成高膽紅素血癥,甚至黃疸。凡能引起膽紅素生成過(guò)多或使肝細(xì)胞對(duì)膽紅素的攝取、結(jié)合和排泄過(guò)程發(fā)生障礙,都會(huì)使血中的膽紅素濃度升高,出現(xiàn)高膽紅素血癥。因此,膽紅素的測(cè)定對(duì)臨床檢測(cè)肝膽疾病、溶血等具有重要的意義。膽紅素氧化酶(bilirubin:oxygen oxidoreductase,EC1.3.3.5,BOD/Br/BOX)是一種多酚氧化酶,最開(kāi)始對(duì)膽紅素氧化酶進(jìn)行研究的是國(guó)外的兩名學(xué)者M(jìn)urao和Tanaka,他們從漆斑菌屬真菌中純化出膽紅素氧化酶,為后來(lái)膽紅素氧化酶的各項(xiàng)研究及應(yīng)用奠定了重要理論基礎(chǔ)。膽紅素氧化酶的來(lái)源特別廣泛,漆斑菌屬是其主要來(lái)源和高產(chǎn)菌,產(chǎn)生膽紅素氧化酶的微生物有鏈霉菌屬、弗蘭克氏菌、粗皮靈芝、微紫青霉菌等;Maitins在研究中發(fā)現(xiàn),枯草芽孢桿菌、芽孢外衣蛋白也有膽紅素氧化酶活性;此外,國(guó)外科研人員在馬鈴薯洋蔥苜蓿和番茄等植物中也都陸續(xù)分離出膽紅素氧化酶。膽紅素氧化酶能催化膽紅素反應(yīng)生成無(wú)毒害作用的膽綠素,主要被用于測(cè)定血清中膽紅素的含量,而血清中膽紅素含量的多少可以作為肝膽病情診斷的重要依據(jù),也能為病理分析提供信息。
結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
膽紅素氧化酶全酶是由蛋白質(zhì)、二價(jià)銅離子和部分碳水化合物組成。蛋白質(zhì) 由17種氨基酸組成,不含半胱氨酸、賴氨酸和蛋氨酸含量較低,每個(gè)分子中不到10個(gè)殘基;天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸含量較高,每個(gè)分子中的殘基數(shù)超過(guò) 40個(gè)。膽紅素氧化酶的前體是由572個(gè)氨基酸殘基組成,包括534個(gè)氨基酸和38個(gè)氨基酸的前導(dǎo)區(qū)。前導(dǎo)區(qū)中碳末端的個(gè)疏水氨基酸與已知信號(hào)肽特征相似,可能也起著信號(hào)肽的作用。膽紅素氧化酶(BOD)的光譜學(xué)特性與多銅氧化酶基本相似,純化后的BOD常呈深藍(lán)色,BOD中含有的銅離子依光譜學(xué)和磁學(xué)特性被分為3種類型,T1銅中心接受來(lái)自于酶的有機(jī)底物電子供體如膽紅素并將所得電子傳遞到O2還原位點(diǎn),目前被廣泛接受的觀點(diǎn)是該蛋白的紫外-可見(jiàn)光譜在約600nm處有一強(qiáng)吸收T1銅特征吸收峰,這主要源于酶底物中的電荷從Cys-S到T1CuII的傳遞繼而電子再被傳遞至O2還原位點(diǎn),這一位點(diǎn)由1個(gè)三核中心組成,包含1個(gè)具有電子 順磁共振活性的T2Cu2+中心和一對(duì)逆磁性與羥基耦合的T3銅離子該三核銅中心,,在UV-Vis區(qū)約330nm處有一明顯的寬肩作為其特征,2010年億報(bào)道從M.verrucarria分離純化并獲得首個(gè)BOD晶體結(jié)構(gòu),此后有關(guān)此酶晶體結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究也陸續(xù)被報(bào)道。
催化機(jī)制
膽紅素氧化酶是一種含銅的多酚氧化酶,它包含三種類型的銅離子。一個(gè)I型銅離子介導(dǎo)電子從底物傳到其他銅位點(diǎn),氧分子束縛在一個(gè)II型銅離子和兩個(gè)III型銅離子形成三核中心上,被還原為兩個(gè)水分子。所以其催化過(guò)程是利用分子氧作為電子受體,有水生成的氧化反應(yīng)。經(jīng)電子吸收光譜及薄層色譜技術(shù)測(cè)定,具體反應(yīng)為 ,過(guò)程為膽紅素氧化酶催化膽紅素生成膽綠素,后者進(jìn)一步氧化生成部分性質(zhì)還不明確的無(wú)色物質(zhì)。研究表明膽紅素氧化酶的催化機(jī)制是對(duì)于被束縛在蛋白質(zhì)上銅離子的二級(jí)反應(yīng),供體結(jié)構(gòu)為CuSS*N2(S=Cys,S*=Met,N=His)類型,和銅藍(lán)蛋白家族相同(如下圖)。在對(duì)黃疽血液進(jìn)行膽紅素氧化酶反應(yīng)中,用HPLC法測(cè)定血液中膽紅素濃度在用膽紅素氧化酶催化后的變化,發(fā)現(xiàn)膽紅素氧化酶可以氧化結(jié)合型膽紅素,也可以氧化非結(jié)合型膽紅素。在ph=5.5和氟化鈉等試劑存在時(shí),膽紅素氧化酶能選擇性地氧化結(jié)合型膽紅素。這種方法能被用于檢測(cè)病人血清中結(jié)合膽紅素濃度的變化。
最適溫度及穩(wěn)定性
膽紅素氧化酶(BOD)酶活與溫度沒(méi)有明顯的相關(guān)關(guān)系。M.oryzae BOD酶活最高溫度為60℃,CotABOD酶活最高溫度達(dá)80 ℃,而來(lái)自M.verrucarria的BOD酶活最高溫度只有40 ℃。在多銅氧化酶家簇中CotA蛋白具有最高的熱穩(wěn)定性,在80℃下半衰期100min,而表現(xiàn)出細(xì)菌蛋白酶的顯著特性。目前對(duì)此現(xiàn)象的解釋有2種,1種使這種蛋白分子的結(jié)構(gòu)較其他蛋白更加緊密,另一種是通過(guò)蛋白晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)這種蛋白中的銅被埋在蛋白質(zhì)更深的結(jié)構(gòu)里所致。在真菌BOD中來(lái)源于M.oryzae的BOD是目前發(fā)現(xiàn)最穩(wěn)定的一個(gè),其半衰期在37℃下300min,在60℃下70min,相比之下自然分泌的M.verrucarriaBOD在60 ℃下的半衰期只有15min,而其在Pachiapastoris中表達(dá)的重組蛋白半衰期在相同溫度下可達(dá)90min。來(lái)自T.tsunodae的BOD14在37℃下90min后酶活喪失50%,與漆酶不同BODs在中性條件下穩(wěn)定如來(lái)自于M.oryzae的BOD在生理?xiàng)l件下孵育8d只喪失15%的酶活性。應(yīng)用
- 用于臨床檢測(cè)和治療
- 用于環(huán)境污水的處理
- 用于生物電池的制造
分離純化
露濕漆斑菌產(chǎn)生的膽紅素氧化酶粗酶液通過(guò)硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow 和Sephadex G-100 純化,得到純化152.54倍膽紅素氧化酶,得率19.14 %。酶的分離與純化過(guò)程為:
1)硫酸銨鹽析、透析:菌種在 28℃下、P DB培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)5d后,經(jīng)8 層紗布過(guò)濾,6000r/min 離心20 min ,所得上清液冷凍過(guò)夜,解凍除去沉淀, 上清液即為粗酶液。80 %飽和度硫酸銨沉淀,4℃ 靜置過(guò)夜。10000r/min離心20 min,棄去上清液,沉淀溶解于蒸餾水中,對(duì)其透析過(guò)夜。
2)DEAE-Sepharose Fast Flow 柱層析:將上述所得酶液加到已用0.01mol/ L 磷酸鈉緩沖液(PBS7.0)平衡過(guò)的DEAE-Sepharose Fast Flow柱(1.8 cm×20 cm), 先用PBS 洗柱,后改用含0~0.5 mol/LNaCl的PBS梯度洗脫,合并有酶活組分, 將所得溶液冷凍干燥成粉。
3)Sephadex G-100 柱層析:將上述所得活力組分的凍干粉溶解于3mL蒸餾水中,所得酶液加到平衡好的層析柱(2.0 cm×80 cm)上,用上述緩沖液洗脫,收集活力較高的組分,并將其凍干,溶解在 2mL的蒸餾水中,-20 ℃下保存。
主要參考資料
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[4] 車暢等. 膽紅素氧化酶的生物電催化. 黑龍江醫(yī)藥.2013,26(2):193-195.
[5] 蔣帥等. 膽紅素氧化酶的應(yīng)用研究進(jìn)展.黑龍江醫(yī)藥.2011,24(6):939-940.
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