80619-01-8
中文名稱
膽紅素氧化酶
英文名稱
BILIRUBIN OXIDASE
CAS
80619-01-8
分子式
N/A
更新日期
2024/12/24 16:34:37
基本信息
中文別名
膽紅素氧化酶膽紅素氧化酶/BOD
膽紅素氧化酶, 10 單位/每毫克蛋白
膽紅素氧化酶, ≥ 50U/MG PROTEIN
BILIRUBIN OXIDASE 膽紅素氧化酶
英文別名
C:C&B9EC 1.3.3.5
Biliruin Oxidase
BILIRUBIN OXIDASE
Oxidase, bilirubin
Bilirubin oxidase M-1
Bilirubin oxidase Amano 3
Bilirubin Oxidase [≥50 units/mg]
BILIRUBIN: OXYGEN OXIDOREDUCTASE
Bilirubin Oxidase [>=10 units/mg]
常見問題列表
背景介紹
膽紅素是動(dòng)物體內(nèi)含鐵卟啉化合物進(jìn)行正常分解代謝的產(chǎn)物，是鐵葉琳化合物在人體內(nèi)代謝產(chǎn)物之一。膽紅素在體內(nèi)起著重要的作用，它是一種抗氧化劑，有助于肝細(xì)胞的再生。但是，一旦出現(xiàn)代謝異常，膽紅素就會(huì)在體內(nèi)積累，形成高膽紅素血癥，甚至黃疸。凡能引起膽紅素生成過多或使肝細(xì)胞對(duì)膽紅素的攝取、結(jié)合和排泄過程發(fā)生障礙，都會(huì)使血中的膽紅素濃度升高，出現(xiàn)高膽紅素血癥。因此，膽紅素的測(cè)定對(duì)臨床檢測(cè)肝膽疾病、溶血等具有重要的意義。膽紅素氧化酶（bilirubin：oxygen oxidoreductase，EC1.3.3.5，BOD/Br/BOX）是一種多酚氧化酶，最開始對(duì)膽紅素氧化酶進(jìn)行研究的是國外的兩名學(xué)者M(jìn)urao和Tanaka，他們從漆斑菌屬真菌中純化出膽紅素氧化酶，為后來膽紅素氧化酶的各項(xiàng)研究及應(yīng)用奠定了重要理論基礎(chǔ)。膽紅素氧化酶的來源特別廣泛，漆斑菌屬是其主要來源和高產(chǎn)菌，產(chǎn)生膽紅素氧化酶的微生物有鏈霉菌屬、弗蘭克氏菌、粗皮靈芝、微紫青霉菌等；Maitins在研究中發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌、芽孢外衣蛋白也有膽紅素氧化酶活性；此外，國外科研人員在馬鈴薯洋蔥苜蓿和番茄等植物中也都陸續(xù)分離出膽紅素氧化酶。膽紅素氧化酶能催化膽紅素反應(yīng)生成無毒害作用的膽綠素，主要被用于測(cè)定血清中膽紅素的含量，而血清中膽紅素含量的多少可以作為肝膽病情診斷的重要依據(jù)，也能為病理分析提供信息。
結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
膽紅素氧化酶全酶是由蛋白質(zhì)、二價(jià)銅離子和部分碳水化合物組成。蛋白質(zhì) 由17種氨基酸組成，不含半胱氨酸、賴氨酸和蛋氨酸含量較低，每個(gè)分子中不到10個(gè)殘基；天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸含量較高，每個(gè)分子中的殘基數(shù)超過 40個(gè)。膽紅素氧化酶的前體是由572個(gè)氨基酸殘基組成，包括534個(gè)氨基酸和38個(gè)氨基酸的前導(dǎo)區(qū)。前導(dǎo)區(qū)中碳末端的個(gè)疏水氨基酸與已知信號(hào)肽特征相似，可能也起著信號(hào)肽的作用。膽紅素氧化酶（BOD）的光譜學(xué)特性與多銅氧化酶基本相似，純化后的BOD常呈深藍(lán)色，BOD中含有的銅離子依光譜學(xué)和磁學(xué)特性被分為3種類型，T1銅中心接受來自于酶的有機(jī)底物電子供體如膽紅素并將所得電子傳遞到O2還原位點(diǎn)，目前被廣泛接受的觀點(diǎn)是該蛋白的紫外-可見光譜在約600nm處有一強(qiáng)吸收T1銅特征吸收峰，這主要源于酶底物中的電荷從Cys-S到T1CuII的傳遞繼而電子再被傳遞至O2還原位點(diǎn)，這一位點(diǎn)由1個(gè)三核中心組成，包含1個(gè)具有電子 順磁共振活性的T2Cu2+中心和一對(duì)逆磁性與羥基耦合的T3銅離子該三核銅中心，，在UV-Vis區(qū)約330nm處有一明顯的寬肩作為其特征，2010年億報(bào)道從M．verrucarria分離純化并獲得首個(gè)BOD晶體結(jié)構(gòu)，此后有關(guān)此酶晶體結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究也陸續(xù)被報(bào)道。
催化機(jī)制
膽紅素氧化酶是一種含銅的多酚氧化酶，它包含三種類型的銅離子。一個(gè)I型銅離子介導(dǎo)電子從底物傳到其他銅位點(diǎn)，氧分子束縛在一個(gè)II型銅離子和兩個(gè)III型銅離子形成三核中心上，被還原為兩個(gè)水分子。所以其催化過程是利用分子氧作為電子受體，有水生成的氧化反應(yīng)。經(jīng)電子吸收光譜及薄層色譜技術(shù)測(cè)定，具體反應(yīng)為 ，過程為膽紅素氧化酶催化膽紅素生成膽綠素，后者進(jìn)一步氧化生成部分性質(zhì)還不明確的無色物質(zhì)。研究表明膽紅素氧化酶的催化機(jī)制是對(duì)于被束縛在蛋白質(zhì)上銅離子的二級(jí)反應(yīng)，供體結(jié)構(gòu)為CuSS*N2(S=Cys，S*=Met，N=His)類型，和銅藍(lán)蛋白家族相同（如下圖）。在對(duì)黃疽血液進(jìn)行膽紅素氧化酶反應(yīng)中，用HPLC法測(cè)定血液中膽紅素濃度在用膽紅素氧化酶催化后的變化，發(fā)現(xiàn)膽紅素氧化酶可以氧化結(jié)合型膽紅素，也可以氧化非結(jié)合型膽紅素。在ph=5.5和氟化鈉等試劑存在時(shí)，膽紅素氧化酶能選擇性地氧化結(jié)合型膽紅素。這種方法能被用于檢測(cè)病人血清中結(jié)合膽紅素濃度的變化。
最適溫度及穩(wěn)定性
膽紅素氧化酶（BOD）酶活與溫度沒有明顯的相關(guān)關(guān)系。M.oryzae BOD酶活最高溫度為60℃，CotABOD酶活最高溫度達(dá)80 ℃，而來自M．verrucarria的BOD酶活最高溫度只有40 ℃。在多銅氧化酶家簇中CotA蛋白具有最高的熱穩(wěn)定性，在80℃下半衰期100min，而表現(xiàn)出細(xì)菌蛋白酶的顯著特性。目前對(duì)此現(xiàn)象的解釋有2種，1種使這種蛋白分子的結(jié)構(gòu)較其他蛋白更加緊密，另一種是通過蛋白晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)這種蛋白中的銅被埋在蛋白質(zhì)更深的結(jié)構(gòu)里所致。在真菌BOD中來源于M.oryzae的BOD是目前發(fā)現(xiàn)最穩(wěn)定的一個(gè)，其半衰期在37℃下300min，在60℃下70min，相比之下自然分泌的M．verrucarriaBOD在60 ℃下的半衰期只有15min，而其在Pachiapastoris中表達(dá)的重組蛋白半衰期在相同溫度下可達(dá)90min。來自T．tsunodae的BOD14在37℃下90min后酶活喪失50％，與漆酶不同BODs在中性條件下穩(wěn)定如來自于M.oryzae的BOD在生理?xiàng)l件下孵育8d只喪失15％的酶活性。應(yīng)用
- 用于臨床檢測(cè)和治療
- 用于環(huán)境污水的處理
- 用于生物電池的制造
分離純化
露濕漆斑菌產(chǎn)生的膽紅素氧化酶粗酶液通過硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow 和Sephadex G-100 純化，得到純化152.54倍膽紅素氧化酶，得率19.14 %。酶的分離與純化過程為：
1）硫酸銨鹽析、透析：菌種在 28℃下、P DB培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)5d后，經(jīng)8 層紗布過濾，6000r/min 離心20 min ，所得上清液冷凍過夜，解凍除去沉淀， 上清液即為粗酶液。80 %飽和度硫酸銨沉淀，4℃ 靜置過夜。10000r/min離心20 min，棄去上清液，沉淀溶解于蒸餾水中，對(duì)其透析過夜。
2）DEAE-Sepharose Fast Flow 柱層析：將上述所得酶液加到已用0.01mol/ L 磷酸鈉緩沖液（PBS7.0）平衡過的DEAE-Sepharose Fast Flow柱（1.8 cm×20 cm）， 先用PBS 洗柱，后改用含0～0.5 mol/LNaCl的PBS梯度洗脫，合并有酶活組分， 將所得溶液冷凍干燥成粉。
3）Sephadex G-100 柱層析：將上述所得活力組分的凍干粉溶解于3mL蒸餾水中，所得酶液加到平衡好的層析柱（2.0 cm×80 cm）上，用上述緩沖液洗脫，收集活力較高的組分，并將其凍干，溶解在 2mL的蒸餾水中，-20 ℃下保存。
主要參考資料
[1] 蔣帥等. 膽紅素氧化酶的應(yīng)用研究進(jìn)展.黑龍江醫(yī)藥.2011,24(6):939-940.[2] 韓旭等. 膽紅素氧化酶的研究進(jìn)展. 黑龍江醫(yī)藥 .2009,22(6):791-793.
[3]黃世臣等. 膽紅素氧化酶的特性及應(yīng)用研究綜述. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào).2014,36(1):78-86.
[4] 車暢等. 膽紅素氧化酶的生物電催化. 黑龍江醫(yī)藥.2013,26(2):193-195.
[5] 蔣帥等. 膽紅素氧化酶的應(yīng)用研究進(jìn)展.黑龍江醫(yī)藥.2011,24(6):939-940.
[6] 張曦等. 膽紅素氧化酶電化學(xué)的應(yīng)用. 黑龍江醫(yī)藥.2013, 26(22):203-205.
[7] 劉友勛等. 露濕漆斑菌膽紅素氧化酶的分離純化及其性質(zhì). 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào).2008,27(3):104-108.