細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO，貨號21875-091)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。
2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲存。
二．細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
方法一：收集細(xì)胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
以下是大鼠角膜上皮細(xì)胞說明書的訂購信息：

       產(chǎn)品描述：公司提供的原代細(xì)胞均來自新鮮組織，公司提供的人源原代細(xì)胞均來自新鮮組織，用于培養(yǎng)該細(xì)胞的組織采集是根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行。細(xì)胞的培養(yǎng)采用公司PrimaCellTM原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒來優(yōu)化目的細(xì)胞生長條件，以降低雜細(xì)胞的污染，同時保證質(zhì)量的穩(wěn)定。在公司技術(shù)部標(biāo)準(zhǔn)的操作流程下，原代細(xì)胞可以保持分化狀態(tài)，進(jìn)而可以用于評估體外藥物模型系統(tǒng)和調(diào)節(jié)特定基因的遺傳功能。

      發(fā)貨：客戶可根據(jù)自身科研項(xiàng)目的需要選擇不同類型的細(xì)胞培養(yǎng)瓶和相應(yīng)的細(xì)胞密度。公司提供的細(xì)胞有標(biāo)準(zhǔn)的鑒定流程，保證細(xì)胞的純度在90%以上，且不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。發(fā)貨的新鮮細(xì)胞還包含:1、發(fā)貨的T25方瓶中裝滿50ml左右完全培養(yǎng)基；2、說明書及注意事項(xiàng)；3、公司售后服務(wù)標(biāo)準(zhǔn)。

      保存和應(yīng)用：客戶可以根據(jù)自己的需求選擇新鮮或者凍存的原代細(xì)胞，如是新鮮原代細(xì)胞，客戶收到細(xì)胞后應(yīng)立即將其放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置后2-3h，再進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作。如是凍存細(xì)胞，客戶收到細(xì)胞后應(yīng)立即將其放入液氮、-80℃冰箱或立即進(jìn)行復(fù)蘇。該細(xì)胞只可用于科研，不得用于臨床應(yīng)用。
實(shí)驗(yàn)報告：
一分離與培養(yǎng)：
    1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；
    2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；
    3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織完全被消化；
    4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
    5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；
二、免疫熒光鑒定：
    1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；
    2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
    3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；
    4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；
    5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；
    6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。
二甲基二烯丙基氯化銨 溶液Human MIP-1α(Macrophage Inflammatory Protein 1 Alpha) ELISA Kit

1,2-二氯乙烷Human MIP-3a/CCL20(Macrophage Inflammatory Protein 3 Alpha) ELISA Kit

1,2-二氯乙烷Human MMP-1(Matrix Metalloproteinase 1) ELISA Kit

1,2-二氯乙烷Human MMP-12(Macrophage metalloelastase) ELISA Kit

1,2-二氯乙烷Human MMP13(Matrix Metalloproteinase 13) ELISA Kit

1,4-二氧雜螺[4.5]癸烷-8-羧酸乙酯,Human MMP-3(Matrix Metalloproteinase 3) ELISA Kit

葡萄糖,一水合物Human MMP-7(Matrix Metalloproteinase 7) ELISA Kit

Diacetato[(S)-(-)-5,5'-bis(diphenylphosphino)-4,4'-bi-1,3-benzodioxole]ruthenium(II),Ru(OAc)2[(S)-segphos]Human MMP-8(Matrix Metalloproteinase 8) ELISA Kit

Diacetato[(S)-(-)-5,5'-bis(diphenylphosphino)-4,4'-bi-1,3-benzodioxole]ruthenium(II),Ru(OAc)2[(S)-segphos]Human MMP-9(Matrix Metalloproteinase 9) ELISA Kit

二安替吡啉甲烷Human MYD88(Myeloid differentiation primary response protein MyD88) ELISA Kit

1,8-二溴萘Human KLK10/NES1(Kallikrein-10) ELISA Kit

1,8-二溴萘Human NGF/NGFβ(Beta-nerve growth factor) ELISA Kit

DL-丙氨酸Human NID-1(Nidogen-1/Entactin) ELISA Kit

3,5-二氯-2-氟吡啶Human NT-3(Neurotrophin-3) ELISA Kit

3,5-二氯-2-氟吡啶Human NT-4(Neurotrophin-4) ELISA Kit
大鼠角膜上皮細(xì)胞說明書Brucella Ab IgG(Human Brucella Antibody IgG) ELISA Kit  人布魯氏菌抗體IgG硫藤黃素  95% GROα/MGSA ELISA Kit

BrdU(Mouse Bromodeoxyuridine) ELISA Kit  小鼠溴脫氧核苷尿嘧啶纈氨霉素 ≥98% (TLC), ≥95% (HPLC), solidGlomerular tissue extract-advanced glycosylation end products,GTE-AGE ELISA Kit

BrdU(Human Bromodeoxyuridine) ELISA Kit  人溴脫氧核苷尿嘧啶蠣灰菌素A 95%Kim-1 ELISA Kit

BrdU ELISA Kit   大鼠溴脫氧核苷尿嘧啶渥曼青霉素  98%renin precursor ELISA kit

BRCA-2(Human breast cancer susceptibility protein 2) ELISA Kit  人乳腺癌易感蛋白2玉米烯酮 99%renin,REN ELISA Kit

BRCA-1(Human breast cancer susceptibility protein 1) ELISA Kit  人乳腺癌易感蛋白1ALPHA-玉米赤霉烯醇  97%Proadrenomedullin,Pro-ADM ELISA Kit

BRAK/CXCL14(Human Breast and kidney expressed chemokine,BRAK) ELISA Kit  人胸腎表達(dá)趨化因子乙酰乙酸基甲基丙烯酸乙酯 95%adrenomedullin,ADM ELISA Kit

BPI-Ab(Human anti-Bactericidal permeability increasing protein antibody) ELISA Kit  人抗殺菌通透性增高蛋白抗體己二酸 Standard for GC,≥99.5%(GC)adrenergic alpha-1A receptor,ADRA1A ELISA Kit

BP180-Ab(Human anti-Bullous Pemphigoid 180 antibody) ELISA Kit  人抗BP180抗體己二酸  AR，≥99%(HPLC)Epinephrine/Adrenaline,EPI ELISA Kit

BP(Human Bullous Pemphigoid) ELISA Kit  人大皰性類天皰瘡抗體己二酸 超純級，≥99.5% (HPLC)adrenal cortex antibody,ACA ELISA Kit

Bombyx mori Livetin,LT ELISA Kit  家蠶卵黃蛋白己二酸 藥用級, 99.6-101.0%Nephrin ELISA Kit

BNP(Human brain natriuretic peptide) ELISA Kit  人腦鈉素/腦鈉尿肽己二酸 ≥99.6%, FCCRenalase/ Monoamine Oxidase-C,RNLS/MAO-C ELISA Kit

BNP ELISA Kit  大鼠腦鈉素/腦鈉尿肽1,2,4-苯三酸酐 97%neuron axon filament protein你
培養(yǎng)操作：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有 1mL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補(bǔ) 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或?qū)?細(xì)胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并 檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。      
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細(xì)胞 1-2 次。
2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。  
3. 按 6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補(bǔ)加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。
4. 將細(xì)胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為類；
1. 細(xì)胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，細(xì)胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清。加 1ml 血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加 入血 清和 DMSO，輕輕混勻，DMSO 終濃度為 10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存 1ml 細(xì)胞懸液，注意凍 存管做好標(biāo)識。
3. 將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱，2 個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取.