Human TIMP-1 ELISA Kit

康朗生物的Human TIMP-1 ELISA Kit (Human Tissue Inhibitors of Metalloproteinases 1 Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit)，即人金屬蛋白酶組織抑制劑1酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，是一種用于特異性地高靈敏地定量檢測人血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清液中的TIMP-1的ELISA試劑盒。
本產(chǎn)品檢測靈敏度高，特異性強，重復性好。多次重復檢測結果表明，最小檢出量為28pg/ml，與人MMP-1、MMP-3、MMP-2、IMP-2和小鼠TIMP-1等均沒有交叉反應，板內、板間變異系數(shù)均小于10%。
基質金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases, MMPs)是一種具有鋅指結構的肽鏈內切酶，能夠催化細胞外基質蛋白發(fā)生降解，從而調控發(fā)育、組織重構、傷口愈合和腫瘤轉移等過程。MMPs以酶原形式分泌，酶原經(jīng)過蛋白水解后變成有活性的MMPs。金屬蛋白酶組織抑制劑(Tissue Inhibitors of Metalloproteinases, TIMP)通過與MMPs形成1:1的復合物抑制MMPs活性。TIMPs與MMPs以非共價鍵相連，能夠阻止MMP與底物連接。TIMP-1屬于誘導型蛋白而TIMP-2屬于組成型蛋白，二者都屬于游離蛋白且分布廣泛；TIMP-3主要分布在細胞外基質，TIMP-4則只存在于心肌組織。
TIMP-1是一種氨基酸長度為184的糖基化蛋白，但糖基化并非維持其活性所必須。TIMP-1具有12個半胱氨酸殘基，參與形成結構中的二硫鍵，分子N端具有與MMP底物結合位點相結合的基團，C端則能夠與MMP外部結合，增強整體的親和力。TIMP-1與無活性的pro-MMP-9具有很強的結合能力，在與pro-MMP-9形成復合物后，TIMP-1憑借N端的結合位點依舊保持著抑制其他活化MMP的能力。
許多細胞和組織都能夠合成TIMP-1。TIMP-1基因的轉錄受到IL-1、IL-6、OSM、LIF和TNF-α等許多細胞因子和佛波酯的調控。TIMP-1的許多生理功能都與MMPs密切相關，MMP/TIMP-1濃度失衡會導致關節(jié)炎、腫瘤生長和轉移等病理改變。另一方面，TIMP-1也具有一些獨立的功能，例如TIMP-1能夠抑制B細胞的凋亡，說明TIMP-1除了抑制MMPs外，還能夠與一些特定細胞結合并進入細胞核內，促進特定細胞的存活和生長。
本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法(Sandwich ELISA)檢測樣品中Human TIMP-1的濃度，其原理見圖1。Human TIMP-1特異的單克隆捕獲抗體已預包被于酶標板上，當加入標準品或樣品時，其中的Human TIMP-1會與捕獲抗體結合。當加入生物素化的抗Human TIMP-1抗體后，生物素化抗Human TIMP-1抗體與Human TIMP-1結合，形成夾心的免疫復合物。隨后加入辣根過氧化物酶標記Streptavidin(HRP-Streptavidin)，由于生物素與鏈霉親和素(Streptavidin)可以特異性地結合，因此鏈霉親和素連接的HRP就會與夾心的免疫復合物連接起來而被固相捕獲。最后加入顯色劑TMB溶液，固相捕獲的辣根過氧化物酶就會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質，在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測450nm處的吸光度值就能實現(xiàn)定量檢測。Human TIMP-1濃度與A450值呈正比，通過繪制標準曲線，對照樣品吸光度值，即可計算出樣品中Human TIMP-1濃度。

圖1. 雙抗體夾心ELISA原理圖。

一個包裝的本試劑盒，包括標準品檢測，可以進行96次檢測。
保存條件：
標準品4℃保存，1-2周內有效，-20℃保存6個月內有效；試劑盒其它組分4℃保存6個月內有效。除標準品外，試劑盒其它組分嚴禁凍存。
注意事項：
由于標準品一般是凍干粉，在制備后需要嚴格校準，所以標準品的瓶數(shù)及每瓶標準品所需加入的稀釋液體積請以實際收到的試劑盒及標準品標簽上的標注為準。
洗滌液(20X)在低溫下可能有結晶，如果發(fā)現(xiàn)有結晶，請室溫水浴加熱使結晶完全溶解后再配制工作液。
為保證標準品的精確性，標準品配制使用后，如果有剩余請勿再次使用。
TMB溶液請勿接觸氧化劑和金屬，否則容易失效。
加樣時，請注意每個樣品或標準品必須更換槍頭，一方面避免交叉污染，另一方面也避免吸取體積的誤差。
由于本試劑盒均經(jīng)過獨立測試，所以請勿混用不同貨號和不同批次的試劑盒組分，即使是同種試劑盒不同批次的試劑盒組分也不能混用。多個試劑盒同時檢測時，請獨立使用各個試劑盒中的試劑，請勿使用不同試劑盒中相同名稱的組分。
充分混勻對保證反應結果的精準性很重要，在加液后請輕輕晃動整個96孔板，以保證混勻。
本試劑盒很多操作在室溫進行，要求嚴格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會導致最終檢測到的吸光度顯著下降。
洗滌過程非常重要，洗滌不充分會使精確度下降并導致結果誤差較大。
檢測標準品和樣品時建議設置重復孔，以確保檢測結果的可信度。
加樣過程中須避免氣泡的產(chǎn)生。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
 

使用說明：
1.樣品準備
a. 樣品的準備請按下列流程進行操作：
(a)細胞上清樣品離心取上清即可(如100-500g，5分鐘)。
(b)對于血清樣品，將全血在室溫下放置30分鐘至2小時，不要劇烈搖晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黃色沉淀。制備好的血清需置于冰上待用。
(c)對于血漿樣品，采集的全血建議使用EDTA進行抗凝處理，混勻后置冰上，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色或淡黃色上清即得血漿，注意不要吸取白色沉淀。制備好的血漿需置于冰上待用。
(d)若待測樣品不能及時檢測，樣品制備后請分裝，凍存于-20℃或-80℃，并注意避免反復凍融。
b.血清樣品不應添加任何防腐劑或抗凝劑。
c.樣品應清澈透明，檢測前樣品中如有懸浮物應通過離心去除。
d.請勿使用溶血、高血脂或污染的樣品檢測，否則結果將不準確。
注：血清或血漿樣品可能需要用1X標準品稀釋液適當稀釋后再檢測。
2.檢測前準備工作
a.試劑盒從冰箱中取出后應置室溫(25-28ºC)平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時置于4ºC保存。
b.配制適當量的標準品稀釋液：將標準品稀釋液(5X)用雙蒸水或去離子水稀釋至1X，例如10ml標準品稀釋液(5X)加40ml水混勻后即為1X的標準品稀釋液。
c.配制適當量的洗滌液：將洗滌液(20X)用雙蒸水或去離子水稀釋至1X，例如10ml洗滌液(20X)加190ml水混勻后即為1X的洗滌液。
d.按標準品標簽上標注的體積加入標準品稀釋液至1瓶標準品中，室溫孵育15分鐘(為確保標準曲線的準確性，切勿縮短孵育時間)。隨后輕輕混勻并用移液槍吹打幾次使標準品徹底溶解，使標準品終濃度達到2000pg/ml。通常每個濃度的標準品需要檢測2個孔，每個孔的標準品用量為100μl，共需200μl，同時稀釋時還需要使用250μl，因此如果1瓶標準品配制后的體積不足0.45ml，請使用更多瓶數(shù)的標準品，并在合并混勻后使用。
e.取5個潔凈的1.5毫升離心管，每管預先加入250μl的標準品稀釋液，并參考圖2進行標準品的倍比稀釋，最終得到2000、1000、500、250、125、62.5pg/ml共六個標準品濃度，最后將稀釋好的標準品依次加入預包被板孔中，標準品稀釋液直接加入作為0pg/ml濃度，共七個標準品濃度。

圖2. 標準品倍比稀釋示意圖。按標準品(STANDARD)標簽上標注體積加入標準品稀釋液溶解并混勻后的濃度為標準品的起始濃度。其它的倍比稀釋后的濃度依次為起始濃度的1/2、1/4、1/8、1/16和1/32。 

3.洗滌方法
自動洗板機或手工洗板：每孔洗滌液為300μl，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣在厚吸水紙上適當用力拍干。
4.實驗過程需自備的材料和儀器
a.不同規(guī)格的移液槍及相應的吸頭
b.酶標儀
c.自動洗板機(如果沒有也可以手工洗板)
d.去離子水或雙蒸水
5.操作步驟
a.計算并確定一次實驗所需的預包被板條數(shù)，取出所需板條放置在96孔框架內，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。
b.每次實驗都需配制標準品并繪制出標準曲線，同時建議設置本底較正孔，即空白孔，設置方法為該孔只加TMB溶液和終止液。
c.分別將樣品或不同濃度標準品按照100μl/孔加入相應孔中，用封板膜(透明)封住反應孔，室溫孵育120分鐘。對于血清或血漿樣品的TIMP-1的檢測，不同樣本稀釋比例不一樣，一般范圍在50-500倍，如無明確范圍，建議從200倍開始稀釋，如果樣本濃度過高，超過檢測范圍，請加大稀釋倍數(shù)后重新檢測。請注意記錄好樣品的稀釋倍數(shù)。
注意：請先查閱相關文獻確定樣品中待檢測蛋白的大致濃度，如果該濃度大于或者小于本試劑盒的最高或者最低標準品濃度，請適當稀釋或濃縮后再進行檢測。
d.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
e.加入生物素化抗體100μl/孔(注：此生物素化抗體已經(jīng)預先配制好，可以直接使用，不必再進行稀釋)。用封板膜(透明)封住反應孔，室溫孵育60分鐘。
f.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
g.加入辣根過氧化物酶標記Streptavidin 100μl/孔(注：此辣根過氧化物酶標記Streptavidin已經(jīng)預先配制好，可以直接使用，不必再進行稀釋)。用封板膜(白色)封住反應孔，室溫避光孵育20分鐘。室溫偏低時(低于25℃)，需要適當延長孵育時間。
h.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
i.加入顯色劑TMB溶液100μl/孔，用封板膜(白色)封住反應孔，室溫避光孵育15-20分鐘。室溫偏低時需要適當延長孵育時間，此時可以孵育至標準品出現(xiàn)非常顯著的顏色變化，若樣本濃度足夠高也會出現(xiàn)顯著的顏色變化。
j.加入終止液50μl/孔，混勻后立即測量A450值。
6.結果分析
a.復孔的值通常在20%的差異范圍內結果才有效，復孔平均值可作為測量值。
b.每個標準品或樣品的吸光度值應減去本底校正孔的吸光度值(如果沒有做校正孔，則不需要減去)。
c.繪制標準曲線。以標準品濃度為橫坐標，A450值為縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過樣品的吸光度值和標準曲線計算出樣品的相應濃度。

圖3. Human TIMP-1 ELISA Kit的標準曲線。實測數(shù)據(jù)會因實驗條件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。 
d.若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重新測定，計算濃度時需注意乘以樣品的稀釋倍數(shù)。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！