Mouse/Rat TGF-β1 ELISA Kit

康朗生物的Mouse/Rat TGF-β1 ELISA Kit (Mouse/Rat Transforming Growth Factor-β1 Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit)，即小鼠/大鼠轉化生長因子β1酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，是一種用于特異性地高靈敏地定量檢測小鼠或大鼠血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清液中的TGF-β1的ELISA試劑盒。
本產(chǎn)品檢測靈敏度高，特異性強，重復性好。多次重復檢測結果表明，最小檢出量為1.8pg/ml，與小鼠TGF-β2、TGF-β3和大鼠TGF-β2、TGF-β3等均沒有交叉反應，板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。由于成熟的大鼠TGF-β1與小鼠TGF-β1具有100%的氨基酸同源性，因此兩種蛋白均能用本試劑盒進行檢測。
轉化生長因子(Transforming Growth Factor, TGF)是一種多效性細胞因子，主要有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三種類型，其具有調節(jié)細胞外基質產(chǎn)生、傷口愈合、免疫應答、細胞增殖和分化多種功能。TGF-β家族還包括骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein, BMP)、生長分化因子(Growth Differentiation Factors, GDFs)和神經(jīng)元營養(yǎng)因子等其他蛋白因子，該家族成員在結構上均能夠形成多個鏈內(nèi)二硫鍵。
TGF-β1的高親和受體是由TGF-β RI和TGF-β RII組成的受體復合物，TGF-β RI和TGF-β RII都屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶受體家族。TGF-β RII與TGF-β結合后，就能夠激活并磷酸化TGF-β RI。活化的TGF-β RI又能激活Smad蛋白，從而調控轉錄過程。TGF-β RI又稱為活化素受體樣激酶(Activin Recptor-like Kinase, ALK-5)，幾乎表達于所有細胞表面，其他兩種I型受體，ALK-1和ALK-2也能夠與TGF-βRII搭檔組成TGF-β信號傳遞受體復合物參與TGF-β信號傳遞。除了TGF-β RI和TGF-β RII，還有第三種TGF-β1受體，TGF-βRIII (β蛋白聚糖或內(nèi)皮糖蛋白)同樣能夠調控TGF-β功能。TGF-β首先與TβRII結合，然后募集并磷酸化TβRI，活化的受體隨后磷酸化受體激活型Smads蛋白(R-Smads)，磷酸化后的R-Smads再與輔助型Smads (Co-Smads)結合，形成異源寡聚體復合物，隨后進入細胞核內(nèi)，調節(jié)目標基因。
本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法(Sandwich ELISA)檢測樣品中小鼠/大鼠TGF-β1的濃度，其原理見圖1。小鼠/大鼠TGF-β1特異的單克隆捕獲抗體已預包被于酶標板上，當加入標準品或樣品時，其中的小鼠/大鼠TGF-β1會與捕獲抗體結合。當加入生物素化的抗小鼠/大鼠TGF-β1抗體后，生物素化抗小鼠/大鼠TGF-β1抗體與小鼠/大鼠TGF-β1結合，形成夾心的免疫復合物。隨后加入辣根過氧化物酶標記Streptavidin(HRP-Streptavidin)，由于生物素與鏈霉親和素(Streptavidin)可以特異性地結合，因此鏈霉親和素連接的HRP就會與夾心的免疫復合物連接起來而被固相捕獲。最后加入顯色劑TMB溶液，固相捕獲的辣根過氧化物酶就會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質，在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測450nm處的吸光度值就能實現(xiàn)定量檢測。小鼠/大鼠TGF-β1濃度與A450值呈正比，通過繪制標準曲線，對照樣品吸光度值，即可計算出樣品中小鼠/大鼠TGF-β1濃度。

圖1. 雙抗體夾心ELISA原理圖。

一個包裝的本試劑盒，包括標準品檢測，可以進行96次檢測。
保存條件：
標準品4℃保存，1-2周內(nèi)有效，-20℃保存6個月內(nèi)有效；試劑盒其它組分4℃保存6個月內(nèi)有效。除標準品外，試劑盒其它組分嚴禁凍存。
注意事項：
由于標準品一般是凍干粉，在制備后需要嚴格校準，所以標準品的瓶數(shù)及每瓶標準品所需加入的稀釋液體積請以實際收到的試劑盒及標準品標簽上的標注為準。
洗滌液(20X)在低溫下可能有結晶，如果發(fā)現(xiàn)有結晶，請室溫水浴加熱使結晶完全溶解后再配制工作液。
為保證標準品的精確性，標準品配制使用后，如果有剩余請勿再次使用。
TMB溶液請勿接觸氧化劑和金屬，否則容易失效。
加樣時，請注意每個樣品或標準品必須更換槍頭，一方面避免交叉污染，另一方面也避免吸取體積的誤差。
同種試劑盒不同批號的試劑盒組分不能混用，每批次試劑盒均經(jīng)過獨立測試。不同試劑盒相同名稱的組分嚴禁混用，多個試劑盒同時檢測時，注意避免混淆相同名稱不同試劑盒的組分。 
充分混勻對保證反應結果的精準性很重要，在加液后請輕輕晃動整個96孔板，以保證混勻。
本試劑盒很多操作在室溫進行，要求嚴格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會導致最終檢測到的吸光度顯著下降。
洗滌過程非常重要，洗滌不充分會使精確度下降并導致結果誤差較大。
檢測標準品和樣品時建議設置重復孔，以確保檢測結果的可信度。
加樣過程中須避免氣泡的產(chǎn)生。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
 

使用說明：
1.樣品準備
a. 樣品的準備請按下列流程進行操作：
(a)細胞上清樣品離心取上清即可(如100-500g，5分鐘)。
(b)對于血清樣品，將全血在室溫下放置30分鐘至2小時，不要劇烈搖晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黃色沉淀。制備好的血清需置于冰上待用。
(c)對于血漿樣品，采集的全血建議使用EDTA進行抗凝處理，混勻后置冰上，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色或淡黃色上清即得血漿，注意不要吸取白色沉淀。制備好的血漿需置于冰上待用。
(d)若待測樣品不能及時檢測，樣品制備后請分裝，凍存于-20℃或-80℃，并注意避免反復凍融。
b.血清樣品不應添加任何防腐劑或抗凝劑。
c.樣品應清澈透明，檢測前樣品中如有懸浮物應通過離心去除。
d.請勿使用溶血、高血脂或污染的樣品檢測，否則結果將不準確。
注：血清或血漿樣品可能需要用1X標準品稀釋液倍比稀釋后再檢測
2.檢測前準備工作
a.試劑盒從冰箱中取出后應置室溫(25-28ºC)平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時置于4ºC保存。
b.配制適當量的洗滌液：將洗滌液(20X)用雙蒸水或去離子水稀釋至1X，例如10ml洗滌液(20X)加190ml水混勻后即為1X的洗滌液。
c.如有5X標準品稀釋液，請按所需用量將稀釋液(5X)用雙蒸水或去離子水稀釋至1X，例如10ml稀釋液(5X)加40ml水混勻后即為1X的稀釋液。
d.按標準品標簽上標注的體積加入標準品稀釋液至1瓶標準品中，室溫孵育15分鐘(為確保標準曲線的準確性，切勿縮短孵育時間)。隨后輕輕混勻并用移液槍吹打幾次使標準品徹底溶解，使標準品終濃度達到2000pg/ml。通常每個濃度的標準品需要檢測2個孔，每個孔的標準品用量為100μl，共需200μl，同時稀釋時還需要使用250μl，因此如果1瓶標準品配制后的體積不足0.45ml，請使用更多瓶數(shù)的標準品，并在合并混勻后使用。
e.取5個潔凈的1.5毫升離心管，每管預先加入250μl的標準品稀釋液，并參考圖2進行標準品的倍比稀釋，最終得到2000、1000、500、250、125、62.5pg/ml共六個標準品濃度，最后將稀釋好的標準品依次加入預包被板孔中，標準品稀釋液直接加入作為0pg/ml濃度，共七個標準品濃度。
f.樣品活化和稀釋：生物樣品中的TGF-β1大部分以無活性的復合物形式存在，檢測前必須活化從而得到有活性的TGF-β1蛋白。本試劑盒提供1N鹽酸溶液進行活化，提供1.2N的堿溶液進行中和，檢測時必須使用中和后的樣品。標準品無需加酸活化。
細胞培養(yǎng)上清的活化及稀釋：取100μl樣品，加入20μl 1N的HCl，混勻后室溫孵育10分鐘。隨后再加入20μl 1.2N的NaOH進行中和。為了計算方便，再加入60μl的1X標準品稀釋液，混勻即可，此時樣品相當于稀釋了2倍。
血清和血漿樣品的活化及稀釋：取40μl樣品，加入20μl 1N的HCl，混勻后室溫孵育10分鐘。隨后再加入20μl 1.2N 的NaOH進行中和。因不同的血清和血漿樣品稀釋比例不一樣，一般稀釋范圍在18-60倍，如無明確范圍，建議從20倍開始稀釋。即在中和后的樣品中加入720μl的1X標準品稀釋液，混勻即可，此時樣品相當于稀釋了20倍。

圖2. 標準品倍比稀釋示意圖。按標準品(STANDARD)標簽上標注體積加入標準品稀釋液溶解并混勻后的濃度為標準品的起始濃度。其它的倍比稀釋后的濃度依次為起始濃度的1/2、1/4、1/8、1/16和1/32。 

3.洗滌方法
自動洗板機或手工洗板：每孔洗滌液為300μl，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣在厚吸水紙上適當用力拍干。
4.實驗過程需自備的材料和儀器
a.不同規(guī)格的移液槍及相應的吸頭
b.酶標儀
c.自動洗板機(如果沒有也可以手工洗板)
d.去離子水或雙蒸水
5.操作步驟
a.計算并確定一次實驗所需的預包被板條數(shù)，取出所需板條放置在96孔框架內(nèi)，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。
b.每次實驗都需配制標準品并繪制出標準曲線，同時建議設置本底較正孔，即空白孔，設置方法為該孔只加TMB溶液和終止液。
c.分別將中和并稀釋后的樣品或不同濃度標準品按照100μl/孔加入相應孔中，用封板膜(透明)封住反應孔，室溫孵育120分鐘。如果檢測時樣品中TGF-β1濃度過高，超過標準曲線最高點，請加大稀釋倍數(shù)后重新稀釋檢測。請注意記錄好樣品的稀釋倍數(shù)。
注意：請先查閱相關文獻確定樣品中待檢測蛋白的大致濃度，如果該濃度大于或者小于本試劑盒的最高或者最低標準品濃度，請適當稀釋或濃縮后再進行檢測。
d.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
e.加入生物素化抗體100μl/孔(注：此生物素化抗體已經(jīng)預先配制好，可以直接使用，不必再進行稀釋)。用封板膜(透明)封住反應孔，室溫孵育60分鐘。
f.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
g.加入辣根過氧化物酶標記Streptavidin 100μl/孔(注：此辣根過氧化物酶標記Streptavidin已經(jīng)預先配制好，可以直接使用，不必再進行稀釋)。用封板膜(白色)封住反應孔，室溫避光孵育20分鐘。室溫偏低時(低于25℃)，需要適當延長孵育時間。
h.洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
i.加入顯色劑TMB溶液100μl/孔，用封板膜(白色)封住反應孔，室溫避光孵育15-20分鐘。室溫偏低時需要適當延長孵育時間，此時可以孵育至標準品出現(xiàn)非常顯著的顏色變化，若樣品濃度足夠高也會出現(xiàn)顯著的顏色變化。
j.加入終止液50μl/孔，混勻后立即測量A450值。
6.結果分析
a.復孔的值通常在20%的差異范圍內(nèi)結果才有效，復孔平均值可作為測量值。
b.每個標準品或樣品的吸光度值應減去本底校正孔的吸光度值(如果沒有做校正孔，則不需要減去)。
c.繪制標準曲線。以標準品濃度為橫坐標，A450值為縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過樣品的吸光度值和標準曲線計算出樣品的相應濃度。

圖3. Mouse/Rat TGF-β1 ELISA Kit的標準曲線。實測數(shù)據(jù)會因實驗條件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。 
d.若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重新測定，計算濃度時需注意乘以樣品的稀釋倍數(shù)。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！