pET-Dual-N-GST-PreScission

pET-Dual-N-GST-PreScission是一種用于在大腸桿菌中高效共表達(dá)兩種目的蛋白的質(zhì)粒，其中一種可以帶上GST標(biāo)簽(Glutathione S-transferase tag, GST tag)并且GST標(biāo)簽后有PreScission蛋白酶的酶切位點(diǎn)。本質(zhì)粒包含兩個多克隆位點(diǎn)(MCS)，每個多克隆位點(diǎn)前都有一個T7啟動子/lac操作子和一個核糖體結(jié)合位點(diǎn) (rbs)，因此都可以在異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的誘導(dǎo)下高效啟動目的蛋白的表達(dá)。本質(zhì)粒為氨芐青霉素抗性。
在共表達(dá)兩個蛋白的復(fù)合物時，通常宜把較難表達(dá)的基因克隆到個多克隆位點(diǎn)，宜把較易表達(dá)的基因克隆到第二個多克隆位點(diǎn)。這樣通過GST柱純化，可分離純化獲得帶有GST標(biāo)簽的蛋白復(fù)合物。本質(zhì)粒的N端GST標(biāo)簽與個多克隆位點(diǎn)之間有PreScission蛋白酶識別的八肽序列LEVLFQGP，對應(yīng)核酸序列為CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCC，配合使用信裕生物云天生產(chǎn)的PreScission Protease (P2302/P2303) 4℃酶切過夜，第二天收集穿柱液即可獲得蛋白復(fù)合物，這為后續(xù)進(jìn)行蛋白復(fù)合物的功能檢測、蛋白結(jié)晶等工作帶來了極大的便利。PreScission蛋白酶酶切發(fā)生在八肽序列的Q和G之間，因此在酶切去除GST標(biāo)簽的時候會在目的蛋白的N端留下兩個額外的氨基酸殘基GP。當(dāng)然，本質(zhì)粒也可以只在個多克隆位點(diǎn)插入目的基因，這樣就會僅表達(dá)一個含有N端GST標(biāo)簽和PreScission識別位點(diǎn)的目的蛋白。
pET-Dual-N-GST-PreScission質(zhì)粒的主要信息如下：

pET-Dual-N-GST-PreScission質(zhì)粒(6065bp)的圖譜如下：

pET-Dual-N-GST的多克隆位點(diǎn)的詳細(xì)圖譜如下：

pET-Dual-N-GST-PreScission中沒有的酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that do not cut pET-Dual-N-GST-PreScission)包括：

pET-Dual-N-GST-PreScission中的單酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that cut pET-Dual-N-GST-PreScission once)包括：

pET-Dual-N-GST-PreScission質(zhì)粒中推薦使用的測序引物序列如下：
MCS1-N Primer (626-647): 5′-GCTATCCCACAAATTGATAAGT-3′
MCS1-C Primer (853-834): 5′-GATTATGCGGCCGTGTACAA-3′ 
MCS2-N Primer (834-853): 5′-TTGTACACGGCCGCATAATC-3′
T7 terminator Primer (1093-1111): 5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′ 
pET-Dual-N-GST-PreScission的全序列信息：D2933 pET-Dual-N-GST-PreScission.txt。
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