QuickMutation™基因隨機突變試劑盒
信裕生物生產(chǎn)的QuickMutation™基因隨機突變試劑盒(QuickMutation™ Random Mutagenesis Kit)是一種基于易錯PCR(Error Prone PCR)的方法使目的基因片段通過PCR擴增后發(fā)生一定幾率的隨機突變的試劑盒。
基因的隨機突變是研究蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、以及抑制或者改良甚至創(chuàng)造蛋白或酶活性的重要方法。
易錯PCR方法通常是指通過易錯耐熱DNA聚合酶進行PCR擴增，從而在目的基因序列中引入隨機突變的方法。易錯PCR方法在目的基因序列中引入隨機突變后，最終很可能在蛋白水平上產(chǎn)生氨基酸序列的突變，從而可以隨機產(chǎn)生活性更強、更弱甚至失去活性的蛋白或酶，也有可能使蛋白或酶產(chǎn)生新的活性。
為了分析蛋白結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，理想的突變應(yīng)該是每個蛋白發(fā)生1個氨基酸改變(1-2核苷酸突變)；在蛋白進化研究方面，理想的突變是每個蛋白發(fā)生1-4個氨基酸改變(約2-7核苷酸突變)；從突變文庫中篩選高活性的蛋白或者酶則通常希望每個基因產(chǎn)生20個左右的核苷酸突變。
本試劑盒提供的RandomMut DNA polymerase，是一種全新的專門用于易錯PCR的DNA聚合酶，在配套的反應(yīng)緩沖液中加入推薦量的Mutation enhancer情況下，可以在每kb的基因中引入約7.8個隨機突變，而且這些突變是AT→GC和GC→AT兩個方向的突變基本均衡的，(AT→GC mutations) / (GC→AT mutations) = 1.06，同時還會引入適量的插入(insertion)和缺失(deletion)突變。
本試劑盒擴增出來的DNA片段為黏性末端，可以直接用于常規(guī)的T載體克隆。
本試劑盒可擴增長達6kb的目的片段。
用戶可以自行調(diào)整本試劑盒的突變幾率，使用更加便捷。本試劑盒提供了Mutation enhancer (10X)，通過改變Mutation enhancer的用量可以顯著影響突變率(參見表1)。
表1. 利用QuickMutation™基因隨機突變試劑盒使用不同濃度的Mutation enhancer PCR擴增1000bp片段后雙酶切插入空載體，然后隨機挑選若干克隆進行測序分析的結(jié)果。PCR擴增的1000bp模板片段插入在約4kb的質(zhì)粒中，測試時1000bp模板的用量是120pg/µl，相當于模板質(zhì)粒的用量為600pg/µl，PCR循環(huán)數(shù)為30。
0.5X Mutation enhancer
1X Mutation enhancer
2X Mutation enhancer
Total mutations found
63
98
134
Mutations
Mutations
Percentage
Mutations
Percentage
Mutations
Percentage
A→T
8
12.7%
10
10.2%
21
15.7%
A→G
10
15.9%
13
13.3%
21
15.7%
T→A
7
11.1%
10
10.2%
15
11.2%
T→C
8
12.7%
15
15.3%
17
12.7%
G→A
11
17.5%
13
13.3%
10
7.5%
C→T
5
7.9%
10
10.2%
13
9.7%
Insertions
1
1.6%
1
1.0%
0
0.0%
Deletions
3
4.8%
4
4.1%
5
3.7%
Bias Indicators (AT→GC/GC→AT)
(AT→GC) / (GC→AT)
1.05
1.06
1.19
A→N, T→N
19+16=35
55.6%
25+29=54
55.1%
46+34=80
59.7%
G→N, C→N
14+10=24
38.1%
23+16=39
39.8%
24+25=49
36.6%
A→G, T→C
18
28.6%
28
28.6%
38
28.4%
G→A, C→T
16
25.4%
23
23.5%
23
17.2%
A→T, T→A
15
23.8%
20
20.4%
36
26.9%
A→C, T→G
2
3.2%
6
6.1%
6
4.5%
G→C, C→G
5
7.9%
7
7.1%
12
9.0%
G→T, C→A
3
4.8%
9
9.2%
14
10.4%
Insertions
1
1.6%
1
1.0%
0
0.0%
Deletions
3
4.8%
4
4.1%
5
3.7%
Mutations/kb (per PCR)
5.5
7.8
10.7
突變堿基數(shù)范圍
0-11
3-12
4-18
本試劑盒如果用于20µl的PCR突變體系，兩種包裝的本試劑盒分別可以進行50次和200次基因隨機突變，如果用于50µl的PCR突變體系，兩種包裝的本試劑盒分別可以進行20次和80次基因隨機突變。
包裝清單：
XY-0219S-1
RandomMut DNA polymerase
20µl
XY-0219S-2
RandomMut buffer (10X)
150µl
XY-0219S-3
Mutation enhancer (10X)
150µl
保存條件：
-20℃保存，一年有效。
注意事項：
PCR反應(yīng)非常靈敏，在使用RandomMut DNA polymerase進行PCR擴增反應(yīng)時請注意避免微量待擴增DNA的污染，并盡量設(shè)置不加模板的空白對照。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. 引物設(shè)計：
a. 引物的長度通常為約20個堿基。
b. 如果引物帶有克隆酶切位點，引物長度通常約為28-30個堿基，其中包含了酶切位點和通常必須添加的保護堿基以確保酶切效率。
c. 引物的GC含量盡量控制在40-60%。
d. 使用經(jīng)過PAGE純化的引物或更高純度的引物。
2. 隨機突變PCR反應(yīng)：
a. 參考下表設(shè)置隨機突變PCR反應(yīng)體系：
雙蒸水或MilliQ水
-
(13.2-x)μl
(33-y)μl
RandomMut buffer (10X)
1X
2μl
5μl
Mutation enhancer (10X)
1X
2ul
5ul
dNTP (2.5mM each)
0.25mM
2μl
5μl
模板DNA
0.2pg/μl -20ng/μl
xμl
yμl
引物混合物(10μM each)
0.2μM each
0.4μl
1μl
RandomMut DNA polymerase
-
0.4μl
1μl
b. 對于不同類型模板DNA的推薦用量如下：哺乳動物基因組DNA 2-10ng/μl；大腸桿菌基因組DNA 0.2pg/μl-2ng/μl；質(zhì)粒DNA模板20pg/μl-5ng/μl，質(zhì)粒DNA模板的起始推薦用量為0.1-1ng/µl。隨機突變擴增的模板DNA濃度越高，隨機突變率則越低。
c. 對于質(zhì)粒DNA模板的具體推薦用量請參考下表。低突變率(0-4.5 mutations/kb)，建議突變擴增的模板DNA用量為1-20ng/μl；中突變率(4.5-9 mutations/kb), 建議突變擴增的模板DNA為0.1-1ng/μl；高突變率(大于9 mutations/kb)，建議突變擴增的模板DNA用量為2-100pg/μl。突變擴增的模板DNA計算：上述推薦量是以擬PCR擴增的目的片段的量(Target amount)進行計算的，而不是以整個質(zhì)粒的量來計算，并且計算的標準是擬擴增片段的大小為1kb。例如低突變率推薦的模板DNA用量為1-20ng/μl時，如果擬擴增片段為1kb，質(zhì)?？偞笮?kb，實際的推薦質(zhì)粒用量為(1-20ng/μl)*(1kb/1kb)*(4kb/1kb)=4-80ng/μl；如果擬擴增片段為2kb，質(zhì)粒總大小為6kb，實際的推薦質(zhì)粒用量為(1-20ng/μl)*(2kb/1kb)*(6kb/2kb)=6-120ng/μl。比較理想的模板用量需要根據(jù)實際突變效果進行適當調(diào)整。
Mutation rate>
Mutations/kb
Target amount/20μl
Target concentration
Low
0-4.5
20-400ng
1-20ng/μl
Medium
4.5-9
2-20ng
0.1-1ng/μl
High
9-16
40pg-2ng
2-100pg/μl
d. 按照如下參數(shù)設(shè)置PCR儀：
步驟
循環(huán)數(shù)
溫度
擴增時間
說明
(a) 上表中1min/kb表示，如果擴增片段是2kb，那么72℃的延伸時間為2分鐘。
(b) 如果發(fā)現(xiàn)目的片段較難被擴增，根據(jù)RandomMut DNA polymerase本身的特性，推薦嘗試使用92℃變性。
(c) PCR反應(yīng)的設(shè)置需根據(jù)模板、引物、PCR產(chǎn)物的長度和GC含量等條件的不同設(shè)定不同的變性、退火和延伸的溫度和時間以及循環(huán)數(shù)等。
(d) 對于初次進行的PCR，為盡量確?？梢詳U增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設(shè)置為30。
3. PCR產(chǎn)物的克隆和測序：
根據(jù)實驗?zāi)康?，可以把PCR產(chǎn)物連入T載體，或者酶切后插入特定的目的載體，隨后即可轉(zhuǎn)化并挑取克隆進行測序，以確認隨機突變的效果。
常見問題：
1. PCR產(chǎn)物非常少：
a. 延伸時間是否足夠，可以將延伸時間調(diào)整為2min/kb。
b. 引物設(shè)計不佳是PCR過程中最常見的問題。請選擇適當?shù)囊镌O(shè)計軟件進行引物設(shè)計，注意引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點等的引物中，一定要注意加入酶切位點等后整條引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。待擴增片斷GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會變得相對比較困難，此時可以使用適合擴增高GC含量DNA片斷的GC-rich buffer，并相應(yīng)地根據(jù)GC-rich buffer的要求或說明調(diào)整PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置。直接添加1-10% DMSO或5-20%甘油對于擴增高GC含量的片段也有幫助。
c. PCR反應(yīng)設(shè)置時在室溫進行容易導致非特異性條件。推薦在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)。
d. 由于引物存在一定的二級結(jié)構(gòu)或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導致退火效果不佳。此時可以采用Touch down等方法進行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55或50℃的方法，使退火更加充分。
e. 退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設(shè)置退火的溫度梯度，摸索退火的溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應(yīng)摸索的退火溫度。
f. 延伸時間不足?？梢栽谕扑]的延伸時間基礎(chǔ)上把延伸時間延長2-5倍，對于較難擴增的片斷可以設(shè)置為每1kb延伸2分鐘。
g. 待擴增片斷GC含量較高或長度較長，變性不夠充分?？梢哉{(diào)節(jié)起始變性條件至94℃ 2-4min甚至94℃ 5min。
h. 在不同PCR儀上進行PCR反應(yīng)，避免有時PCR儀出現(xiàn)問題。
i. 循環(huán)數(shù)不足，適當延長PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為25-35。
j. 模板中含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，可以用適當?shù)腄NA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。
k. 對PCR引物進行脫鹽純化。
l. 使用高質(zhì)量的dNTP混合物。
m. 適當增加DNA polymerase的用量。
n. 當產(chǎn)生較多非特異性條帶時，可以適當提高退火溫度。
o. 注意設(shè)置適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ胀ǔ泻艽髱椭?br />
p. 使用完整、高純度、高質(zhì)量的DNA模板，且避免模板反復凍融。長片段DNA反復凍融過程中可能會出現(xiàn)斷裂的問題。
q. Mg2+濃度較低，或Mg2+與dNTP的比例不合適。使用本產(chǎn)品中提供的緩沖液就無需擔心鎂離子濃度的問題。
r. 根據(jù)片段大小選擇合適的瓊脂糖凝膠濃度和電泳條件。大片段DNA的電泳需要使用低濃度的瓊脂糖凝膠和較低的電泳電壓，并電泳較長的時間。
s. PCR反應(yīng)體系中有氣泡或者PCR管蓋子漏氣導致有溶液蒸發(fā)。
2. 雜帶較多或條帶彌散：
a. 退火溫度提高2-5℃。
b. 減少DNA模板的用量。
c. PCR反應(yīng)設(shè)置時在室溫進行容易產(chǎn)生非特異性條帶。推薦在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)。
d. 適當減少DNA Polymerase的用量。
e. 適當縮短延伸時間。
f. 減少循環(huán)數(shù)可減少非特異性條帶的產(chǎn)生。
3. 隨機突變率結(jié)果不理想：
a. 突變率偏低。
(a) 可適當提高Mutation enhancer (10X)的使用量至使用標準推薦用量1.2、1.5甚至2倍的用量(參考表1)。注意：隨著Mutation enhancer (10X)的用量增多，AT→GC/GC→AT的比值會越高，即AT變成GC的傾向越高。
(b) 可采用連續(xù)易錯PCR策略：即將一次易錯PCR擴增得到的突變幾率較低的產(chǎn)物作為下一次待擴增的模板，連續(xù)兩次甚至多次進行易錯PCR隨機突變，使每一次擴增獲得更多的突變，并且也可以通過這種方法累積有益突變。
(c) 減少突變擴增的模板DNA用量，并增加擴增的循環(huán)數(shù)，減少模板用量并增加擴增的循環(huán)數(shù)會提高突變幾率。擴增的循環(huán)數(shù)最多可以增加到35-40個循環(huán)。
b. 突變率偏高。
(a) 可適當減少Mutation enhancer (10X)的使用量至使用標準推薦用量0.8或0.5倍的用量。
(b) 可通過提高突變擴增的模板DNA用量(500-1000ng)來減少突變率。
(c) 減少PCR循環(huán)數(shù)至20~25個循環(huán)。
關(guān)鍵字： QuickMutation?基因隨機突變試劑盒說明書；QuickMutation?基因隨機突變試劑盒廠家
上?？道噬锟萍加邢薰臼且患壹邪l(fā)、生產(chǎn)、銷售、服務(wù)于一體的一家生物科技企業(yè)，專營生化試劑、標準品、基因、蛋白、抗體、Elisa試劑盒、細胞生物學，分子生物學等高生物產(chǎn)品?？偛课挥谏虾?，并在北京、廣東，江西，吉林等全國30多個省市設(shè)有分公司和代理機構(gòu)。涉及的產(chǎn)品被中國科學院、清華、北大、復旦，上海交大，復旦醫(yī)學院，上海中醫(yī)藥大學，華東師范大學，第二軍醫(yī)大學，曙光醫(yī)院，浦東新區(qū)人民醫(yī)院等知名科研院所廣泛使用，可靠而穩(wěn)定的質(zhì)量和完善的售后服務(wù)確。