捻轉(zhuǎn)毛細線蟲染料法熒光定量PCR試劑盒
Capillaria contorta
它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據(jù)捻轉(zhuǎn)毛細線蟲保守序列設計的專一性引物，與相關病毒無交叉反應。
3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。
4. 一管式熒光定量 PCR 檢測，避免后續(xù)污染。
5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。
6. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。
規(guī)格及成分
儲存條件：-20℃以下，有效期12個月。
使用方法：
一、樣品采集：
1、食品樣品：樣品的采集與預培養(yǎng)按照樣品的采集與預培養(yǎng)按照《食品衛(wèi)生微生物學檢驗阪崎腸桿菌檢驗要求進行。
2、血液樣品：用無菌注射器抽取受檢者靜脈血2mL，注入無菌EDTA2Na(或檸檬酸鈉)抗凝管，立即混勻。
3、糞便樣品：取糞便置于滅菌的收集管中送檢。
4、病灶部位樣品：取發(fā)病部位新鮮滲出物、粘液膿血送檢。
一、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）
1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。
2. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
注：上述樣品建議經(jīng)過增菌后，收集培養(yǎng)物用于檢測。
二、DNA提?。?/strong>
可采用PCR試劑盒配備的DNA抽提液，按以下說明進行DNA核酸的粗提。也可采購上海澤葉生物科技有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒(過柱法-熒光配套)或其他合適的商業(yè)化產(chǎn)品，并按照相應試劑盒說明進行操作。
1、液體培養(yǎng)物：取液體培養(yǎng)物100μL加到1.5mL無菌離心管中，8000rpm離心3min，盡量吸棄上清，加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min，取上清5μL進行PCR反應。
2、固體培養(yǎng)物：挑取單克隆菌落與50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min，取上清5μL進行PCR反應。
3、糞便樣品：挑取米粒大小糞便于滅菌離心管中，加入0.5mL生理鹽水，振蕩混勻，13000rpm離心3分鐘，棄上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min取上清5μL進行PCR反應。
4、其他液體標本：取標本2-3mL，13000rpm離心3min，棄上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min取上清5μL進行PCR反應。
注：陽性對照和陰性對照為已經(jīng)抽提好的核酸(無需提取)，直接取5μL加入到反應體系中即可。由于陽性對照濃度較高，建議最后在樣品制備區(qū)域加入陽性對照。
檢測步驟：
三、設置qPCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）
10. 如果只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個
樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復，則反應設置數(shù)量相應增加2或3倍。
11. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
捻轉(zhuǎn)毛細線蟲 PCR
引物混合液（白蓋）
第 7 步所得 PCR 陽性對照稀釋液（2-7 號）
各 6μL（2 號樣到
2 號管，3 號樣到 3
號管…）
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照，其他熒光PCR儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。
蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。
2．qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件：
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設置為FAM
四、結(jié)果分析：
1．結(jié)果分析條件設定
直接讀取檢測結(jié)果。基線和閾值設定原則根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準。
2．試驗成立判定
1）陰性對照(NTC)：不應產(chǎn)生任何的擴增曲線。
2）陽性對照(ESKZ -PTC)：均產(chǎn)生擴增曲線，且Ct值≤35。
3）以上條件應同時滿足，否則，此次試驗視為無效。
3．結(jié)果判定
1）在試驗成立的條件下，Ct值≤35的樣本為陽性，表明阪崎腸桿菌核酸陽性。
2）Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明阪崎腸桿菌核酸陰性。
3）如果35＜Ct值≤40，判為可疑樣品。對于可疑樣品，先看擴增曲線。如果擴增曲線為對數(shù)擴增曲線，則為可疑陽性，否則判為陰性。
4）對于可疑陽性樣品，重新抽提核酸，再次進行阪崎腸桿菌real time PCR檢測。如果重復擴增曲線為對數(shù)擴增曲線，判為樣本陽性，表明阪崎腸桿菌核酸陽性；否則判為樣本陰性。
五、注意事項：
1）初次使用前請仔細閱讀說明書。并嚴格按照說明書步驟操作。
2）所有使用的離心管應高壓滅菌，而且必須不含DNA酶。
3）PCR操作應嚴格按照要求分區(qū)(試劑配制區(qū)、標本處理區(qū)、PCR擴增區(qū)等)，防止實驗室污染。
4）樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區(qū)的超凈工作臺進行，以免污染。
5）試劑盒里所有物品應視為污染物對待，按照衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。
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上海澤葉生物科技有限公司是一家服務于生命科學領域的高新技術企業(yè)，主要為科研機構(gòu)、高校、院所及企業(yè)產(chǎn)品開發(fā)研究提供所需要的科研類試劑、耗材、儀器、技術服務等。包括分子生物學、免疫學、微生物學、細胞學、材料科學，通用試劑、藥物合成試劑、手性化合物、催化劑及配體、分析試劑、生物試劑，檢測試劑等等