一站式MBP標(biāo)簽蛋白純化套裝

產(chǎn)品及特點(diǎn)MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白，Maltose Binding Protein）標(biāo)簽蛋白大小為 40kDa，由大腸桿菌 K12 的 malE 基因編碼。MBP 可增加在細(xì)菌中過量表達(dá)的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。如果蛋白在細(xì)菌中表達(dá)，MBP 可以融合在蛋白的 N 端或 C 端。MBP 融合蛋白可通過交聯(lián)淀粉親和層析一步純化，結(jié)合的融合蛋白可用 10 mM 麥芽糖在生理緩沖液中進(jìn)行洗脫。如果要去除 MBP 融合部分，可用位點(diǎn)特異性蛋白酶切除?？捎?MBP 抗體或表達(dá)的目的蛋白特異性抗體檢測 MBP 標(biāo)簽標(biāo)記的重組蛋白。由于 MBP 融合蛋白原核表達(dá)載體具有表達(dá)效率高，易于純化等優(yōu)點(diǎn)。在現(xiàn)代分子克隆中 MBP 常作為融合蛋白被廣泛應(yīng)用。本產(chǎn)品就是專門用于分離純化 MBP 融合蛋白的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 一站式套裝，含所需的直鏈淀粉和瓊脂糖介質(zhì)、溶液和層析柱，操作非常方便。

2. 提供 2 mL 直鏈淀粉-瓊脂糖介質(zhì)，其載量為 10 mg MBP 蛋白/mL介質(zhì)。

3. 采用麥芽糖溫和洗脫，無去污劑和變性劑對蛋白活性的影響。

4. 本試劑盒足夠 20 次制備，但介質(zhì)可以反復(fù)使用更多次（需要復(fù)活）。
規(guī)格及成分 成份 編號(hào) 大紙盒包裝
直鏈淀粉-瓊脂糖介質(zhì) LM130871A 2 mL
1 M Tris-HC（l pH 7.4） 25-07640 25 mL
0.1 M EDTA 溶液 131181 25 mL
2 M NaCl 溶液 25-06280 50 mL
蔗糖 57-50-1 20 g
PMSF（10 mg/mL） 100833 1 mL
0.1 mM MgCl2溶液 130871B 50 mL
0.1 M 麥芽糖溶液 130871C 25 mL
層析柱（6 mL） 110809 1 支
使用手冊 130871sc 1 份

運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸和保存，但介質(zhì)需 4℃保存，PMSF 需要-20℃保存，有效期一年。

自備試劑 去離子水、20%乙醇、0.22 μm 或 0.45 μm 濾膜

使用方法 1. 將直鏈淀粉-瓊脂糖介質(zhì)充分混勻后，取適量加入到預(yù)放了一片篩板的層析

柱中（介質(zhì)用量需要根據(jù) MBP 蛋白產(chǎn)量決定，其載量為 10 mg MBP

蛋白/mL 介質(zhì)，請根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要取適量的介質(zhì)加入層析柱中）。

2. 用 5 倍柱體積（柱體積指的是填料介質(zhì)的體積，下同，本試劑盒介質(zhì)的體積

是 2mL）自備去離子水洗柱，共 3 次。

3. 用 5 倍柱體積（約 10mL）的新配的結(jié)合緩沖液洗柱，進(jìn)行平衡，使填料介

質(zhì)處于與目的蛋白相同的緩沖體系下，起到保護(hù)蛋白的作用。結(jié)合緩沖液的

配方如下（以 10 mL 為例）：

成分 用量 在結(jié)合緩沖液中的濃度

1 M Tris-HCl（pH 7.4） 0.2 mL 20 mM

0.1 M EDTA 溶液 0.1 mL 1 mM

2 M NaCl 溶液 1 mL 200 mM

自備去離子水 8.7 mL - 4. 4℃ 5000 g 離心 10 分鐘收集 20 mL 表達(dá)菌液，棄上清，將細(xì)胞沉淀（約

100 mg）懸于 2 mL 冰冷的現(xiàn)配的細(xì)胞洗滌液中，4℃ 5000 g 離心 15 分

鐘收集細(xì)胞沉淀后，再次懸于 2 mL 冰冷的細(xì)胞洗滌液中。（用不加誘

導(dǎo)物的菌液做對照樣。）細(xì)胞洗滌液的配方如下（以 10 mL 為例）：

成分 用量 在細(xì)胞洗滌液中的濃度

1 M Tris-HCl（pH 7.4） 0.1 mL 10 mM

2 M NaCl 溶液 0.15 mL 30 mM

自備去離子水 9.75 mL - 5. 制備細(xì)胞裂解物：

1) 如果所用載體不帶 MBP 信號(hào)肽序列（如 pMAL-c2）

a) 超聲破碎細(xì)胞，功率 30 W，保持細(xì)胞低溫（0℃），直到在顯微鏡

下看見絕大多數(shù)細(xì)胞破裂。（超聲參數(shù)需根據(jù)儀器型號(hào)自行摸索，

但裂解物必須不粘稠，否則會(huì)堵塞層析柱。）

b) 為使溶液澄清，向上述細(xì)胞洗滌液中加入 35 uL PMSF（10

mg/mL）。

c) 4℃下 13000-15000 g 離心 30 分鐘，以去除殘留細(xì)胞和細(xì)胞碎片

以防堵柱，收集上清樣品，留樣做 SDS-PAGE 電泳對照，其余樣

品用于純化 MBP 融合蛋白，直接進(jìn)入第 6 步。

2) 如果所用載體帶 MBP 信號(hào)肽序列（如 pMAL-p2）

a) 4℃ 5000 g 離心 15 分鐘收集細(xì)胞，沉淀懸于 1 mL 冰冷的現(xiàn)配

的細(xì)胞裂解液中。細(xì)胞裂解液的配方如下（以 10 mL 為例）：

成分 用量 在細(xì)胞裂解液中的濃度

1 M Tris-HCl（pH 7.4） 0.3 mL 30 mM

0.1 M EDTA 溶液 0.01 mL 0.1 mM

蔗糖 2 g 20%（m/V）

自備去離子水 加水到 10 mL - b) 加入 25 uL PMSF（10 mg/mL），室溫?cái)噭?dòng) 15 分鐘，于 4℃

13000-15000 g 離心 10 分鐘收集細(xì)胞。

c) 旋動(dòng)細(xì)胞沉淀，加入 2 mL 冰冷的 0.1 mM MgCl2溶液，4℃攪動(dòng)

10 分鐘。

d) 休克細(xì)胞 4℃ 13000-15000 g 離心 10 分鐘，在上清中加入 10

mM Tris-HCl（pH 7.4）（可將 1 M Tris-HCl，pH 7.4 稀釋 100

倍配制而成）至 pH 為 7.4。

e) 上清用 0.22 μm 或 0.45 μm 濾膜過濾，濾液用 100 倍體積的

10 mM Tris-HCl（pH 7.4）（配方如上）4℃透析。

f) 收集透析后樣品，留樣做 SDS-PAGE 電泳對照，其余樣品用于純

化 MBP 融合蛋白，直接進(jìn)入第 6 步。

6. 將樣品加到平衡好的直鏈淀粉-瓊脂糖介質(zhì)中（保證目的蛋白與介質(zhì)充分接

觸，以提高目的蛋白的回收率），收集流出液。

7. 用 10-15 倍柱體積的結(jié)合緩沖液（配方見上表）進(jìn)行清洗，去除非特異性

吸附的雜蛋白，收集洗雜液。

8. 使用 5-10 倍柱體積的現(xiàn)配的麥芽糖洗脫液洗脫結(jié)合的融合蛋白，收集洗脫

液（即目的蛋白組分）。麥芽糖洗脫液的配方如下（以 10 mL 為例）：

成分 用量 在麥芽糖洗脫液中的濃度

1 M Tris-HCl（pH 7.4） 0.2 mL 20 mM

0.1 M EDTA 溶液 0.1 mL 1 mM

0.1 M 麥芽糖溶液 1 mL 10 mM

自備去離子水 8.7 mL - 9. 將純化得到的樣品（包括流出液、洗雜液和洗脫液）以及原始樣品使用

SDS-PAGE 檢測純化效果。

10. 填料介質(zhì)清洗：依次使用 3 倍柱體積的結(jié)合緩沖液和 5 倍柱體積的去離子

水平衡介質(zhì)，最后再用 5 倍柱體積的 20%的乙醇平衡，然后保存在等體積

的 20%的乙醇中，置于 4℃保存，防止填料被細(xì)菌污染。本介質(zhì)可重復(fù)使

用。 蛋白酶切割釋放靶蛋白（可選步驟，所用試劑需自備）

11. 用適當(dāng)?shù)牡鞍酌盖懈钊诤系鞍揍尫虐械鞍住?/p>

1) 加入自備的凝血酶、腸激酶或 Xa 因子（根據(jù)融合蛋白中的位點(diǎn)選擇）。

每毫升介質(zhì)中加入 50 單位的溶于 1 mL PBS 溶液的蛋白酶。顛倒離心

管數(shù)次混勻，室溫下振蕩 2-16 小時(shí)。

2) 4℃以 500 g 離心 5 分鐘，上清小心轉(zhuǎn)移到新離心管中。

3) 用傳統(tǒng)的層析方法或 SDS-PAGE 電泳分離靶蛋白和蛋白酶。