細(xì)菌膜蛋白質(zhì)微量提取試劑盒

產(chǎn)品及特點(diǎn)本試劑盒是基于超速離心的快速提取細(xì)菌膜蛋白的試劑盒。其原理是裂解細(xì) 胞后，通過超速離心分離出細(xì)胞膜和附著的蛋白質(zhì)。跟傳統(tǒng)的密度梯度離心法和去 污劑法相比，本方法具有下列特點(diǎn)：

1. 一步式分離細(xì)胞膜和膜蛋白，密度梯度離心法簡(jiǎn)單快捷。

2. 膜蛋白純度高，能夠去除各種胞漿蛋白的污染，也能去除松散附著在細(xì)胞膜上 的蛋白，所得膜蛋白主要是整合蛋白。

3. 膜蛋白完整性好，主要是由于實(shí)際中有抑制蛋白酶成分。

4. 回收效率高，一般能得到相當(dāng)于總蛋白量 6%的膜蛋白。

5. 可用于 E. coli，S. typhimurium，K. aerogens，P. aeruginosa，C. crescentus 等細(xì)菌。 
規(guī)格及成分 成 分 編 號(hào) 大扁盒包裝
細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白提取溶液 A LM100929a 125 mL
細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白提取溶液 B LM100929b 25 mL
細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白提取溶液 C LM100929c 250 mL
DNase I 干粉 131230 3.5 mg
使用手冊(cè) 100929sc 1 份

運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸和保存，但 DNase I 需要低溫運(yùn)輸，-20℃保存。有效期一年。

自備試劑 膜蛋白溶解液（取決于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果后續(xù)實(shí)驗(yàn)為 SDS-PAGE，則用 1× SDS-PAGE 上樣液作為溶解液；如果用于 2D 電泳，則使用 1×等電點(diǎn)電泳上樣 液作為溶解液）。 

使用方法

準(zhǔn)備：一次使用本試劑盒時(shí)需要將所有 DNase I 干粉倒入溶液 B 中，輕柔顛倒 使 DNase 干粉溶解。未用完的部分需要放-20℃保存，好在一個(gè)月內(nèi)完，否則 DNase 將逐漸失去活性。此外，好在實(shí)驗(yàn)前 1 小時(shí)將溶液 B 冰浴預(yù)冷。 

用法一：小量制備（主要用于上樣量比較小的 SDS-PAGE 電泳等實(shí)驗(yàn)）

1、 收集 20-40 mL 過夜培養(yǎng)的細(xì)菌飽和培養(yǎng)液（OD420 在 1.5 左右即可），2500 g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。

2、 加入 2 mL 溶液 A，輕柔吹打，將細(xì)菌重懸于溶液 A 中。

3、 2500 g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。 4、 加入 0.5 mL 溶液 B（必須已經(jīng)提前加入了 DNase I 干粉），輕柔吹打使細(xì)菌 重懸。注：如果細(xì)菌起始量沒有 20-40 mL，溶液 A 的用量可以等比例降低。 重懸在溶液 A 中的細(xì)菌可以放-80℃長(zhǎng)期保存。 

5、 用超聲或 French Press 方法裂解細(xì)胞。如果用 French Press 方法，則需要 處理至少兩次，每次的壓力為 9.65×10E7（=14000 psi）。注意：不論用哪 種裂解方法，都必須在顯微鏡下檢查細(xì)菌是否已經(jīng)裂解，否則還需要重復(fù)細(xì)菌 裂解過程，直到 80%以上的細(xì)菌都裂解為止。

6、 2500g 室溫離心 8 分鐘后小心轉(zhuǎn)移上清到新的 10 mL-15 mL 塑料離心管中 （如 Beckman Optima 臺(tái)式超速離心機(jī)離心管），棄沉淀（未破裂細(xì)胞）。

7、 在上清（細(xì)菌裂解液）中加入 5 mL 預(yù)冷的溶液 C，輕柔顛倒混勻后冰浴放置 30-60 分鐘。其間可以輕柔顛倒混勻 3-5 次。

8、 用 Bechman Optima 臺(tái)式超速離心機(jī) 115，000g 4℃離心 60 分鐘。也可以 使用其他冷凍超速離心機(jī)，但離心力應(yīng)該一致，否則有可能得不到沉淀。

9、 小心移棄上清，在沉淀中加入 0.2 mL 溶液 A，充分吹打混勻。

10、用 Beckman Optima 臺(tái)式超速離心機(jī) 115，000g 4℃離心 60 分鐘。也可 以使用其他冷凍超速離心機(jī)，但離心力應(yīng)該一致，否則有可能得不到沉淀。 11、小心移棄上清，所得沉淀放-20℃長(zhǎng)期保存，也可以直接加入 0.1 mL 自備的， 跟后續(xù)實(shí)驗(yàn)兼容的緩沖液（如 1×SDS-PAGE 上樣液中，可從本公司購買）， 所得膜蛋白的濃度將在 1mg/mL 左右。

用法二：大量制備（主要用于上樣量比較大的 2D 電泳等實(shí)驗(yàn)） 

1、 收集 200-400 mL 過夜培養(yǎng)的細(xì)菌飽和培養(yǎng)液（OD420 在 1.5 左右即可），2500 g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。

2、 加入 20 mL 溶液 A，輕柔吹打，將細(xì)菌重懸于溶液 A 中。

3、 2500 g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。

4、 加入 5 mL 溶液 B（必須已經(jīng)提前加入了 DNase I 干粉），輕柔吹打使細(xì)菌重懸。注：如果細(xì)菌起始量沒有 200-400 mL，溶液 A 的用量可以等比例降低。重懸在溶液 A 中的細(xì)菌可以放-80℃長(zhǎng)期保存。

5、 用超聲或 French Press 方法裂解細(xì)胞。如果用 French Press 方法，則需要處理至少兩次，每次的壓力為 9.65×10E7（=14000 psi）。注意：不論用哪種裂解方法，都必須在顯微鏡下檢查細(xì)菌是否已經(jīng)裂解，否則還需要重復(fù)細(xì)菌裂解過程，直到 80%以上的細(xì)菌都裂解為止。

6、 2500g 室溫離心 8 分鐘后小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的玻璃燒杯中，棄沉淀（未破裂細(xì)胞）。

7、 在上清（細(xì)菌裂解液）中加入 50 mL 預(yù)冷的溶液 C，輕輕在冰浴中攪拌混勻30-60 分鐘。注：可以在大燒杯中裝冰，然后將裝有樣品的小燒杯放入，在放

入干凈的攪拌子，以低速度攪拌。

8、 用 Beckman Type 55.2 Ti 轉(zhuǎn)頭 115，000g 4℃離心 60 分鐘。也可以使用其他冷凍超速離心機(jī)，但離心力應(yīng)該一致。

9、 小心移棄上清，在沉淀中加入 2 mL 溶液 A，充分吹打混勻。

10、用 Beckman Type 55.2 Ti 轉(zhuǎn)頭 115，000g 4℃離心 60 分鐘。也可以使用其他冷凍超速離心機(jī)，但離心力應(yīng)該一致。

11、小心移棄上清，所得沉淀放-20℃長(zhǎng)期保存或溶解在 1 mL 自備的，跟后續(xù)實(shí)驗(yàn)兼容的緩沖液（如 1×等電點(diǎn)電泳上樣液，可從本公司購買），所得膜蛋白的濃度在 1mg/mL 左右。