包涵體大量純化試劑盒
產(chǎn)品及特點本產(chǎn)品是基因包涵體微量純化試劑盒（CAT#：90508）的大提升級產(chǎn)品，用于大量，快速的提取高質(zhì)量的包涵體。它具有下列特點：

1. 大量提取，1 次可處理多達 5 升的菌液，相當(dāng)于 50 次中量提取。

2. 適合制備級別的包涵體純化，需在 50 mL 以上的離心管或離心瓶中完成。

3. 能有效去除包涵體中的細胞壁和細胞膜等非重組蛋白成份，使重組蛋白在包涵體中所占比重達到 60%以上。

4. 即可以選擇高壓裂解法，也可以采用酶學(xué)裂解法裂解細菌。

5. 得到的包涵體可以用于重折疊，也可以用于凝膠層析和動物免疫。
包涵體大量純化試劑盒
規(guī)格及成分 成 份 編 號 2 次包裝
包涵體大量純化溶液 A 90510A 100 mL
包涵體大量純化溶液 B 90510B 250 mL×2
包涵體溶解液 90510C 100 mL
溶菌酶 100406 100 mg
使用手冊 90510sc 1 份

包涵體大量純化試劑盒運輸及保存 常溫運輸，4℃保存（溶菌酶需要-20℃保存，包涵體溶解液可以室溫保存），有效 期一年。

自備試劑 如果得到的重組蛋白確有降解則需要自備蛋白酶抑制劑混合物（CAT#：80808）

使用方法 一． 細胞沉淀：
1. 轉(zhuǎn)移 1-5 升菌液到干凈的、預(yù)稱重量的塑料離心瓶中。如果離心瓶體積不夠大，可以分多次反復(fù)離心收集。
2. 5,000 g （相當(dāng)于 Sorvall GSA 轉(zhuǎn)頭 5500 rpm） 4℃離心 15-30 分鐘，小心棄上清。
3. 復(fù)稱重量，差值就是細菌的濕重。1 升的過夜培養(yǎng)的大腸桿菌濕重一般為 3 克，所以 1-5 升菌液一般能得到 3-15 克細菌。注意：后續(xù)操作的很多溶液都是按此步得到得細胞濕重添加。
4. 細胞沉淀可以立即使用或存放在-80℃待用。 二． 細胞裂解(下面兩法中選其一)：高壓破碎法（French Press）+超聲法（推薦方法）
1. 按每克細菌濕重加入 3 mL 溶液 A 重懸細胞，可以用玻璃棒攪拌或用 Waring搗碎機勻漿（如果細菌濕重超過 10 克）使細菌懸浮，直到檢測不到成塊的細胞為止。如有必要，可以加入溶菌酶干粉，使其終濃度為 0.2mg/mL。
2. 讓細胞通過壓力為 16000-18000 lb/in2的高壓細胞破碎儀，收集的細胞裂解液需放冰上。
3. 重復(fù)上步操作一次或多次，直到絕大部分細菌都被裂解。注意：每次處理后在顯微鏡下檢查細菌裂解的比例。
4. 將細胞裂解液置于冰浴中，用超聲破碎儀滿功率下超聲處理 5 分鐘，工作狀態(tài)
為 50%（開 0.5 秒，關(guān) 0.5 秒）。此過程中將細胞裂解液放冰上并用磁力
攪拌器攪拌，否則產(chǎn)生的熱量會使包涵體蛋白變性，在純化中丟失。 酶法+超聲法（在沒有高壓破碎儀器時首選方法）
1. 按每克細菌濕重加入 3 mL 的含溶菌酶的溶液 A 重懸細胞，可以用玻璃棒攪拌細菌沉淀使之懸浮。
2. 在細菌懸浮液中加入溶菌酶干粉，使其終濃度為 0.2mg/mL，攪拌混勻后 37℃放置 30 分鐘裂解細菌，其間不時需要用玻璃棒混勻。細菌釋放出的 DNA 將使裂解物變得十分粘稠。如果不粘稠，說明裂解不充分，需要繼續(xù)裂解，否則完整細菌將和包涵體一起沉淀，影響包涵體的純度。由于處理量大，在顯微鏡下檢查細菌是否充分裂解。
3. 將細胞裂解液置于冰浴中，用超聲破碎儀滿功率下超聲處理 5 分鐘，工作狀態(tài)為 50%（開 0.5 秒，關(guān) 0.5 秒）。此過程中將細胞裂解液放冰上并用磁力攪拌器攪拌，否則產(chǎn)生的熱量會使包涵體蛋白變性，在純化中丟失。 三． 包涵體純化：
1. 將超聲處理的細胞裂解液轉(zhuǎn)移到離心瓶中，22，000g 4℃下高速離心 60 分鐘（注意：轉(zhuǎn)子不同其對應(yīng)的離心速度不同），小心收集上清。上清含有以可溶形式存在的重組蛋白，可以保留作為 SDS-PAGE 對照樣品。
2. 將沉淀（主要由包涵體構(gòu)成）懸浮在預(yù)冷的溶液 B 中。每克細菌需要 5 mL 溶液 B，1 升細菌的濕重約 3 克，大約需要 15 mL 溶液 B，用玻璃棒或勻漿器攪拌混勻后室溫放置 5 分鐘。
3. 22，000g 4℃下高速離心 30 分鐘，沉淀將出現(xiàn)三層，最下面的是未徹底破裂的細胞碎片，其上是包涵體，最上層的松軟沉淀是細胞壁和細胞外膜。如果處理過程中使用過溶菌酶，則此層較薄。小心收集上清，可以作為包涵體次洗滌的對照樣品。
4. 重復(fù)第 8-第 9 步直到上清變清和最上層細胞壁和細胞外膜松軟沉淀消失，此過程一般需要重復(fù)洗滌 2 次（共 3 次洗滌），小心收集上清作為包涵體第二次洗滌和第三次洗滌的對照樣品。本試劑盒提供的溶液 B 足夠一次 5 升規(guī)模的
提取洗 3 次，如需更多溶液 B 請單獨購買。
5. 上步得到的沉淀即為包涵體，其中重組蛋白一般占 60%重量，其余 40%為其蛋白質(zhì)。此沉淀可以長期放置在-80℃冰箱待用，也可以直接用于免疫動物制備抗體，還可以直接進入下面得包涵體的溶解步驟。
6. 估計重組蛋白的產(chǎn)率：首先需要通過預(yù)實驗知道重組蛋白的表達水品，如果表達水平為 1%，則 1 克濕重的細菌中將含有 1 mg 重組蛋白質(zhì)。此法得到的重組蛋白質(zhì)的回收率一般在 75%，即 1mg 重組蛋白質(zhì)能得到 0.75 mg，丟失0.25mg。 四．包涵體的溶解：
1. 在室溫下，將包涵體溶解液加入到包涵體沉淀中，用槍頭充分吹打后漩渦震蕩。如果需要將溶解的包涵體直接用于凝膠過濾層析進一步純化，則按每克原始細胞濕重加入 1 mL 包涵體溶解液，重組蛋白的濃度約為 4-5 mg/mL；如果需要將溶解的包涵體直接用于蛋白質(zhì)折疊，則按每克原始細胞濕重加入 3 mL 包涵體溶解液, 重組蛋白的濃度約為 1-2 mg/mL；注意：包涵體溶解液低溫放置會產(chǎn)生沉淀，必須 45-65℃溶化并混勻后才能使用。
2. 室溫放置 1 小時使蛋白質(zhì)充分溶解。
3. 100,000g 4℃離心 60 分鐘(轉(zhuǎn)速需要根據(jù)離心機轉(zhuǎn)子的大小換算)，小心收集上清，保留不溶性沉淀。注意：檢查離心管能否承受此離心力。SDS-PAGE檢查是否大部分重組蛋白都在上清中。如果沒有，說明包涵體沒有完全溶解，需要用適當(dāng)增加包涵體溶解液的用量。
4. 將上清（溶解的包涵體）分成 10-20mL 一份，放于塑料離心管中（不要超過離心管容量的 70%）置-80℃長期保存或直接用于復(fù)性等試驗。由于不同的蛋白質(zhì)有不同的復(fù)性條件，需要用戶自己摸索。包涵體純化過程中引入了溶菌酶，在 SDS-PAGE 分析時可能有額外條帶出現(xiàn)。