DNA探針變性液

產(chǎn)品及特點雜交反應(yīng)進行時，探針和靶核酸都必須是單鏈的。如果用雙鏈 DNA 探針 進行雜交（包括檢測 RNA 時），雙鏈 DNA 探針在雜交前必須進行變性。本 產(chǎn)品就是即用型的 DNA 探針變性液，專門針對 DNA 探針在雜交前進行變性 處理。本產(chǎn)品特點如下：

1. 即開即用。

2. 使用方便快捷，可用于核酸雜交。 
規(guī)格及成分 成份 編號 10 mL 塑料袋包裝
本產(chǎn)品 LM131208 10 mL
使用手冊 1 份

運輸及保存 常溫運輸和保存，有效期一年。

自備試劑 印跡膜、標記探針、6×SSC、2×SSC、0.1×SSC、超級雜交液、Tris-Cl 溶液（1 M，pH 7.2）、HCl 溶液（0.4 M）

使用方法一、根據(jù)探針和靶分子的不同，分別按下面不同情況計算雜交分子的 Tm 值

1. 對 DNA-DNA 雜交，其 Tm = 81.5 + 16.6×log10[Na+ ] + 0.41×GC% –500/L 說明：L 是探針或靶分子的長度（用兩者中最短的一個） GC%是探針或靶分子中的 GC 百分比（用兩者中最短的一個） Na+ 濃度是超級雜交液中 Na+ 的濃度，為 0.75 M，16.6×log10[Na+ ]= （-2.07） 2. 對 DNA-RNA 雜交，其 Tm 值比 DNA-DNA 的 Tm 值要高 10-15℃。 3. 對 RNA-RNA 雜交，其 Tm 值比 DNA-DNA 的 Tm 值要高 20-25℃。 4. 對 Oligo 探針雜交，Tm=GC 數(shù)量×4℃+AT 數(shù)量×2℃。

二、確定佳雜交溫度（預(yù)雜交溫度跟雜交溫度應(yīng)該一樣）

1. 對于大于 200 bp 的 DNA-DNA 雜交，佳雜交溫度一般比 Tm 低 15-25℃，一般選擇 68℃。

2. 對 RNA-RNA 或 DNA-RNA 雜交，佳雜交溫度一般比 Tm 低 15-25℃。 如果這樣計算出的雜交溫度很高（如高于 70℃），則 RNA 容易降解，所 以好選用含甲酰胺的超級雜交液（超級雜交液 B 型），以便能在 42℃ 完成雜交。

3. 對 Oligo 探針的雜交，佳雜交溫度一般比 Tm 低 5℃。由于 Oligo 較短， 更容易受各種因素影響（如錯配率、修飾堿基比例等），所以佳溫度需 要適度摸索和優(yōu)化。

三、確定洗膜溫度

一般使用 0.1×SSC 做洗膜液，在此條件下的佳洗膜溫度比 Tm 低 5-12℃，一般情況下可以在 55℃進行洗膜。Oligo 探針可以室溫洗膜。

四、預(yù)雜交步驟

預(yù)雜交就是用不含探針的超級雜交液跟印跡膜進行孵育，其目的是用所含 的非特異性 DNA 分子(鮭精 DNA 或小牛胸腺 DNA)及其它高分子化合物將印 跡膜上會非特異地吸附探針分子的位點封閉，否則這些位點會吸附標記的探 針，造成高背景。 1. 將結(jié)合了靶分子的硝酸纖維素印跡膜或尼龍印跡膜浸泡于自備的 6× SSC 溶液中，使其充分濕潤。

2. 將濕潤的印跡膜置于一塑料雜交袋中（塑料袋好預(yù)先封口，再剪掉一角， 留一個小口），按每平方厘米印跡膜加 0.2 mL 超級雜交液的比例沿小口 加入超級雜交液，然后用塑料封口機將口封牢。

3. 將此塑料袋浸沒入溫度設(shè)定在佳雜交溫度的恒溫水浴中或雜交爐中，保 溫 1-2 小時，延長到 12-16 小時亦可。注意保溫過程中塑料袋應(yīng)在不停 的搖動狀態(tài)中，使超級雜交液與印跡膜充分接觸。

五、雜交步驟

1. 如果標記的探針是雙鏈核酸，則需經(jīng)變性處理。具體操作是：根據(jù)探針濃 度和雜交所需探針的量計算出所需的探針體積，取出所需體積的探針到一 干凈的硅化的塑料離心管中，加入等體積的本產(chǎn)品，吹打混勻后室溫放置 5 分鐘變性后，將探針樣品放入冰浴中冷卻，加入 0.05 倍體積的自備的 1 M 的 Tris-Cl 溶液（pH 7.2）以及等體積的自備的 0.4 M 的 HCl 溶液。 將探針樣品保存在冰浴中直至需要。如果是單鏈 DNA 或 RNA 探針，則 不需變性，直接使用。

2. 將單鏈探針或變性后的雙鏈探針加入到完成了預(yù)雜交的雜交袋中（先用剪 刀剪一小口，加入探針后用熱封機封口）。探針的加入量視探針標記效率 而定，一般要求終濃度不能低于 1-2 ng/mL。如果檢測基因組中的單拷 貝基因，探針的加入量應(yīng)加大，而對于檢測克隆的基因片段，則探針的量 可減少。如果是放射性探針，應(yīng)將此塑料袋套在另一塑料袋之中，以避免 雜交袋發(fā)生遺漏、污染工作環(huán)境。

3. 在選定的雜交溫度下繼續(xù)保溫，時間一般為 6-12 小時。

六、洗膜步驟。注意在下面的所有操作過程中，一定不要使印跡膜干燥。 此步是將與印跡膜非特異結(jié)合的探針分子洗去而只留下特異結(jié)合的探針 分子。由于非特異性雜交的雜交分子解鏈溫度較低，熱穩(wěn)定性較差，在一定的 溫度和較低的離子強度下，即可洗掉。

1. 雜交完畢，取出塑料袋，剪去一角，倒出所有的含探針的雜交液。此含探 針的雜交液可以多次使用再倒棄。

2. 剪開雜交袋，用鑷子取出印跡膜，浸沒于大量的 2×SSC（含 0.5 % SDS） 溶液中，室溫下振蕩漂洗 15 分鐘。

3. 重復(fù)上步操作一次。

4. 將印跡膜轉(zhuǎn)移至 0.1×SSC（含 0.1% SDS）溶液中，在計算好的洗膜溫 度下振蕩漂洗 30 分鐘至 1 小時。

5. 重復(fù)上步操作一次。如果是同位素標記探針，則需要重復(fù)至用蓋革計數(shù)器 在無核酸區(qū)域檢測不出放射信號為止。

6. 將印跡膜轉(zhuǎn)移到濾紙上，吸去表面液體后印跡膜即可用于后續(xù)檢測。