Ribo-SPIA cDNA擴(kuò)增試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn) 血液樣品和各種臨床樣品（包括組織檢查、FFPE 切片或少量細(xì)胞樣品）都是基因表達(dá)分析和診斷的常見材料，但這些樣品通常數(shù)量有限，質(zhì)量不高，并且還沒法進(jìn)行第二次取樣。所以得到足夠 RNA 量供后續(xù)試驗(yàn)是一個(gè)非常棘手的瓶頸。為解決這一問題，本公司根據(jù) Ribo-SPIA 技術(shù)，開發(fā)了本產(chǎn)品。Ribo-SPIA 技術(shù)的核心是利用 DNA/RNA 嵌合引物，以帶 polyA 尾巴的 mRNA 為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并得到雙鏈 cDNA、RNase H 不間斷地在 cDNA 第 1 鏈中的 RNA 部分產(chǎn)生裂口，DNA聚合酶以此裂口為基礎(chǔ)進(jìn)行鏈取代聚合反應(yīng)，產(chǎn)生 cDNA 單鏈。此技術(shù)原理圖如下：本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)：

1. 高效，能線性擴(kuò)增 1000-10000 倍，能用 5-100 ng 總 RNA 模板擴(kuò)增得到 5 ug

左右的單鏈 cDNA（擴(kuò)增的 cDNA 主要來源于總 RNA 中的 mRNA）。

2. 步驟簡(jiǎn)單方便，擴(kuò)增在恒溫進(jìn)行，只需要 4 個(gè)小時(shí)，不需要特殊儀器設(shè)備。

3. 保真性好，保持 RNA 樣品中各分子的相對(duì)豐度。

4. 尤其適用于 RNA 產(chǎn)量和質(zhì)量都不高的樣品。

5. 擴(kuò)增得到的單鏈 cDNA 能直接用于各種后續(xù)試驗(yàn)，包括 qPCR、芯片分析、雜交反應(yīng)等。

6. 本產(chǎn)品足夠做 10 次雙鏈 cDNA 的合成，20 次 SPIA 擴(kuò)增。
Ribo-SPIA cDNA擴(kuò)增試劑盒
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 20 次塑料袋包裝
cDNA 一鏈合成緩沖液 130308A 40 uL
MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 60905 10 uL
cDNA 二鏈合成緩沖液，5× 130308B 160 uL
cDNA 二鏈合成酶混合液 20× 130308C 40 uL
SPIA RT 引物 Yw1193 40 uL
SPIA 反應(yīng)液，5× 131083A 320 uL
SPIA 擴(kuò)增引物 Yw1192 320 uL
SPIA 酶混合液 131083D 120 uL
超純水 100935 1 mL
使用手冊(cè) 1 份

Ribo-SPIA cDNA擴(kuò)增試劑盒運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期為 1 年。 

使用方法 一：樣品 RNA 的制備

本產(chǎn)品不含 RNA 相關(guān)試劑，用于 Ribo-SPIA 擴(kuò)增的每個(gè)批次的 RNA 樣品先做一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)?？?RNA 樣品的濃度必須在 1-20ng/uL，一次 RIBO-SPIA 所需總 RNA 的量為 1ug。也可以使用 mRNA，一次 Ribo-SPIA 所需總 mRNA 的量為5-100 ng。過低則需要濃縮，過高則需要用無 RNase 的水稀釋。RNA 必須經(jīng)過DNase 處理，不能含 DNA 污染。微量提取時(shí)不能使用核酸類的助沉劑。注意：本產(chǎn)品只能擴(kuò)增含帶 polyA 尾巴的 RNA，不能擴(kuò)增DNA 和不含 polyA 尾巴的 RNA。

二：一管式雙鏈 cDNA 的合成

1. 在 0.5mL PCR 管中，按下表配制雙鏈 cDNA 合成反應(yīng)。注意：每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)陰性對(duì)照組，在此對(duì)照中用超純水替代自備的 mRNA 或總 RNA:

成分 用量

自備 mRNA 或總 RNA

4 uL mRNA（5-100ng）

或 4 uL 總 RNA（1ug）

SPIA RT 引物 20uM 1 uL

65℃ 5 分鐘后室溫放置 2 分鐘，短暫離心后放 4℃

cDNA 一鏈合成緩沖液 4 uL

MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1 uL

輕柔吹打混勻后得到 10uL 的反應(yīng)體系。42℃保溫 90 分鐘合成

鏈 cDNA。結(jié)束后 70℃保溫 15 分使酶變性，最后 4℃放

置，然后加入下列成分，得到 80uL 反應(yīng)體系。

超純水 50 uL

cDNA 二鏈合成緩沖液 16 uL

cDNA 二鏈合成酶混合液 4 uL

輕柔吹打混勻后，短暫離心，16℃保溫 2 小時(shí)合成 cDNA 第二

鏈，然后 75℃ 15 分滅活酶，最后 4℃放置待用

三：SPIA 擴(kuò)增
2. 在 0.5mL PCR 管中，按下表配制 20uL 的 SPIA 反應(yīng)體系。注意：設(shè)置兩個(gè)陰性對(duì)照組，在此兩個(gè)對(duì)照中分別用超純水替代 SPIA 引物和 cDNA 雙鏈反應(yīng)液。

成分 用量

cDNA 雙鏈反應(yīng)產(chǎn)物 40 uL(來于上步)

SPIA 擴(kuò)增引物 10uM 16 uL

SPIA 反應(yīng)液，5× 16 uL

超純水 42 uL

94℃20 秒后 50℃放置復(fù)性待用

SPIA 酶混合液 6 uL

輕柔吹打混勻后得到 120 uL 反應(yīng)體系，50℃擴(kuò)增 60 分鐘，最

后 4℃放置

四：SPIA 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

3. 取 5uL SPIA 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 PAGE 電泳檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)結(jié)果是產(chǎn)生長(zhǎng)度在200-2000bp 之間的產(chǎn)物。

4. 如果產(chǎn)物將用于 PCR 定量，則可以不經(jīng)過純化直接使用，如果需要用于芯片雜交和濃度測(cè)定，則需要按常規(guī)的方法純化 cDNA 以便去除殘留的 dNTP 和引物。

5. OD 檢測(cè)純度和濃度。在 OD260 的波長(zhǎng)下測(cè)樣品你給的光吸收。由于擴(kuò)增產(chǎn)物是單鏈 DNA，故 1OD260=33ug/mL。

6. 所得 DNA 可以放-20℃長(zhǎng)期放置。