NF-KB p65活性檢測
一、核轉(zhuǎn)錄因子NF-kappaB介紹
1、核轉(zhuǎn)錄因子NF-kappaB（NF-kB）是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控多種與炎癥、抗凋亡、腫瘤形成和轉(zhuǎn)化有關(guān)的基因表達(dá)。
2、NF-kappaB（NF-kB）最初被鑒定為在B細(xì)胞中和免疫球蛋白k輕鏈的增強子結(jié)合。但隨后在非B-細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)，形成NF-kB和IkB的復(fù)合物。最初在DNA結(jié)合蛋白復(fù)合物中分離的NF-kB是由p65(RelA)和p50構(gòu)成的異源雙聚體。其他分離的單體包括p49（也可稱為p52），p75（c-Rel）,p68(RelB)。p65，p68，p75單體起反式激活作用。p50，p49（p52）單體具有DNA結(jié)合活力，但只具有微量的反式激活作用。據(jù)報道p49和NF-kB的單體p65形成具有轉(zhuǎn)錄活力的異源雙體，類似于p50/ p65異源雙體。p49/ p65和p50/ p65異源雙體在細(xì)胞質(zhì)中受一種叫IkBa/MAD-3的抑制劑調(diào)節(jié)。
二、NF-kappaB p65檢測原理
1、IkB和p65單體結(jié)合，阻制了細(xì)胞核中的定位和DNA的結(jié)合。在體外高濃度的p65能形成同源雙聚體，能和DNA微弱地結(jié)合。Poly(dI:dC)能抑制這一反應(yīng)（14）。p49和p50也能形成同源雙聚體，但在細(xì)胞中的濃度很低。通常，在作NF-kB的凝膠遷移實驗時，在20ul的反應(yīng)體積中，有溶于10 mM HEPES的0.28pmoles 的NF-kB9寡核苷酸（pH7.9), 50mMKCl, 0.2mMEDTA, 2.5mM DTT, 10%甘油, 0.05%NP-40。當(dāng)用純化的蛋白時，250-300ng足以形成凝膠遷移復(fù)合物，而需用10ug的HeLa細(xì)胞核抽提物。凝膠遷移復(fù)合物在室溫中保溫30分鐘，在50mMTris(pH8.3)和38mM甘氨酸的7%聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離凝膠遷移復(fù)合物。
2、含考馬斯蘭和二甲苯藍(lán)色素的加樣溶液只能加入到陰性對照反應(yīng)中，因這兩種色素會加劇NF-kB復(fù)合物的解離。當(dāng)用HeLa細(xì)胞核抽提物作為結(jié)合蛋白來源時，可形成兩種序列特異的凝膠遷移復(fù)合物，即p50/p50同源雙聚體和p50/ p65異源雙聚體。在表達(dá)p49，p50，p65的細(xì)胞中，可檢測到4個序列特異的凝膠遷移復(fù)合物（p49/ p49，p50/ p50，p50/ p65，p49/ p65），如果存在高濃度的p65，可檢測到微量的p65/p65。
3、下列試劑可加強NF-kB在體外的結(jié)合：mM的GTP，ATP，精胺，亞精胺，鋇或鈣離子，ng的Co+3(NH3)6（12）。
4、提取組織或細(xì)胞核蛋白，利用不同形式的NF-Κb p65抗體捕獲細(xì)胞核蛋白并加以區(qū)分，通過酶標(biāo)儀450nm處測定核蛋白標(biāo)準(zhǔn)品與NF-Κb p65吸光度值，進(jìn)行定量比較，從而明確目的蛋白的活化度。
關(guān)鍵字： NF-KB P65_活性檢測_生化試驗_
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