重組蛋白原核表達服務

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卡梅德生物多年致力于重組蛋白表達，抗體制備研究，我們目前擁有大量的商業(yè)化表達載體質(zhì)粒包括多種標簽質(zhì)粒（His，GST，SUMO，F(xiàn)LAG等標簽）以及高質(zhì)量的擴增和表達菌株（包括低溫誘導表達菌株，10-16℃低溫誘導表達），以保證每一個重組蛋白表達的品質(zhì)。
重組蛋白表達服務 — 原核表達
大腸桿菌（E.coli）重組蛋白表達技術經(jīng)過多年的發(fā)展，已經(jīng)變得非常成熟。但要在大腸桿菌表達體系獲得不錯的可溶以及高產(chǎn)量的蛋白表達，一個優(yōu)秀的表達策略必不可少。卡梅德生物科技的專家在蛋白表達和抗體制備方面具有獨到的經(jīng)驗和豐富的知識儲備，對每一個客戶提出的特殊要求，我們盡可能提出完美的解決方案。為了表達重組蛋白的高效表達以及有活性蛋白的表達，通常以下幾個方面會涉及：

問題1：宿主體系選擇
首先要強調(diào)的是客戶要求不同，我們選擇的表達宿主體系也不盡相同：細菌、酵母、絲狀真菌和單細胞藻類。每一種表達宿主都有各自的優(yōu)缺點。例如，如果需要表達的蛋白具有真核的翻譯后修飾（糖基化修飾），那么大腸桿菌等原核表達體系并不適用。大腸桿菌表達體系的優(yōu)點是：
（1）菌體繁殖速度快：20分鐘倍增一次，這意味著按照1/100的比例接種（MOI），只需要幾個小時培養(yǎng)基細菌即可到達穩(wěn)定期；
（2）容易實現(xiàn)高密度培養(yǎng)：理論培養(yǎng)密度是1 × 1013 cells/ml，實際培養(yǎng)過程中使用LB培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)大腸桿菌，<1 × 1010 cells/ml。在低溫（11℃）誘導蛋白表達時，細菌個數(shù)幾乎不增長。
（3）轉(zhuǎn)染外源DNA容易，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率高。

問題2：表達質(zhì)粒體系選擇
目前最為常用的重組蛋白表達質(zhì)粒載體融合了復制子(Replicon)、啟動子(promoter)、篩選標簽(selection marker)、多克隆位點（MCS）和融合蛋白移除策略(fusion tag removal strategy)

復制子：包含復制起始點及相關順式作用控制元件（cis-acting control elements）。在選擇合適的質(zhì)粒載體時，質(zhì)?？截悢?shù)應當是需要我們考慮的一個重要參數(shù)。卡梅德生物擁有幾個常用的載體系列，如pET、pUC、pACYC 、pBAD和pSC101。pET系列載體含有pMB1起始子，在單個菌體中通常含有15-60 copies；pUC系列含有一個突變版本的pMB1起始子，在該系列的載體在單個細菌通常有500–700 copies；pACYC和pBAD系列常被用于雙表達體系，如FRET系統(tǒng)，該系列含有p15A起始子，單個細胞含有10-12個copies；pSC101系列載體單個細胞中的拷貝數(shù)通常<5個，常被用于三種蛋白的共表達。結(jié)合這些質(zhì)粒的特點，我們的科學家通過改造pET載體，獲得雙表達質(zhì)粒（BiPlasmid vector），該質(zhì)粒含有雙MCS位點，雙T7啟動子，雙lac操縱子和雙核糖體結(jié)合位點，利用該質(zhì)粒我們可以為客戶進行一次轉(zhuǎn)染操作，而獲得兩種蛋白的獨立表達。

啟動子：重組蛋白大腸桿菌表達體系中，lac啟動子是最為常用的啟動子之一。當培養(yǎng)基中只存在乳糖（lactose）作為唯一碳源時，lac啟動子被激活，開始重組蛋白表達。我們常用帶T7啟動系統(tǒng)的pET系列載體為客戶表達目的蛋白，當含有T7啟動系統(tǒng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入細菌后，挑取單克隆，培養(yǎng)并加入IPTG（異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，一種非水解性的乳糖類似物）誘導細菌表達重組蛋白。為了消除重組蛋白本底表達，我們在原先的pET系列質(zhì)粒載體基礎上加入了T7溶酶體與T7 RNAP（RNA polymerase）共表達，T7溶酶體能夠結(jié)合T7 RNA聚合酶并限制T7啟動子介導的起始轉(zhuǎn)錄。

抗性篩選標簽：質(zhì)粒載體通常采用的抗性基因包括氨芐青霉素，卡那霉素，氯霉素，慶大霉素和四環(huán)素等抗性基因，在重組蛋白表達與純化過程中，大部分加入的外源抗生素自然降解(如氨芐青霉素37℃條件下半衰期為16小時)或被去除掉，只剩下微量殘留（一般<1pg/ml純化蛋白），我們開發(fā)了相應的ELISA試劑盒能夠快速檢測抗生素殘留量（檢測靈敏度0.1pg/ml）。

親和標簽：重組蛋白表達過程中采用親和標簽一方面是為了使蛋白純化過程更加容易；另一方面是為了促進某些不溶性蛋白可溶。蛋白標簽可分兩類：一類是短肽類標簽；一類是長肽以融合蛋白（fused partner）形式共表達。長肽類標簽更多的作用是促進蛋白可溶性，往往需要同時加入短肽標簽以幫助蛋白純化；短肽類標簽一般只含幾個氨基酸，分子量均<2 kDa，對重組蛋白的性質(zhì)影響較小。親和標簽可以放置在蛋白的C-端和N-端，如需要表達分泌性蛋白，則放置于C-端，信號肽放置于N-端。不同的蛋白標簽需要根據(jù)具體案例來分析，卡梅德生物總結(jié)了常用的一些蛋白標簽性質(zhì)

標簽移除：一般性的生物學研究過程中，蛋白標簽可以不用移除，如GST pull down實驗和CO-IP實驗則需要保留GST和His標簽以便將目的蛋白從混合物中直接分離出來。當涉及到蛋白結(jié)構(gòu)研究時，則蛋白標簽或融合伴侶需要被移除掉。去除蛋白標簽的方法分為兩類，一類是酶消化法；一類是化學裂解法?；瘜W裂解法通產(chǎn)被用于融合伴侶蛋白的移除，如CNBr用于裂解與Met氨基酸C-端連接的多肽，該方法優(yōu)點是價格便宜，缺點是蛋白序列中不能存在Met氨基酸殘基。酶消化法是目前最為常用的蛋白標簽去除方法，如腸激脢（Enterokinase），凝血酶（thrombin），factor Xa和煙草蝕刻病毒蛋白酶 (TEV protease)等移除蛋白標簽，只殘留少數(shù)幾個氨基酸殘基。帶有His標簽的TEV蛋白酶逐漸被廣泛接受用于蛋白標簽移除實驗，該蛋白酶具有一個非常優(yōu)秀的特點:切除標簽后，只殘留一個Ser或Gly殘基或完全不殘留氨基酸殘基。這也是目前卡梅德生物科技常用的一種蛋白標簽去除方法。

問題三：選擇合適的蛋白表達宿主

重組蛋白原核表達常采用BL21（DE3）和K-12衍生菌株作為表達宿主。Studier 于1986年提出BL21菌株，隨后不同基因工程修飾菌株隨之誕生。BL21菌株缺乏Lon蛋白酶和外膜蛋白酶OmpT，Lon蛋白酶主要功能是降解外源蛋白，外膜蛋白酶OmpT主要功能是降解胞外基質(zhì)蛋白。同時BL21菌株具有先天性的hsdSB基因突變，菌株失去甲基化和降解外源轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的能力，使得質(zhì)粒能夠傳代保留至子代細菌中（hsdSB突變基因來源于父輩B834菌株）。

K-12系列菌株具有兩大優(yōu)點：一個是能夠促進胞質(zhì)中蛋白二硫鍵的形成，主要原因是trxB（thioredoxin reductase）基因發(fā)生突變；另外一個是recA基因突變，改基因突變后外源質(zhì)粒在宿主菌種中得以穩(wěn)定存在。

問題四：成功表達一個重組蛋白，需要的策略組合

重組蛋白的表達往往不像理論那樣一帆風順，在實際的表達過程中有可能產(chǎn)生各種各樣的問題。

在選擇一個的蛋白表達策略非常困難的情況下，那么采用看似笨拙的方法，有可能會成為一種意想不到的“成功捷徑”，比如項目要求構(gòu)建表達兩種重組蛋白時，構(gòu)建6種不同的表達質(zhì)粒，意味著有36種不同的表達條件組合，通過高通量微量蛋白表達實驗一次性就可獲得蛋白表達條件組合，后續(xù)中式飛行試驗和成本控制會變得相對容易。

我們的服務優(yōu)勢：

*密碼子優(yōu)化：包含稀有密碼子分析，蛋白親水性分析和跨膜結(jié)構(gòu)域的預測分析

*多種融合標簽載體和宿主，以保證高可溶蛋白表達和高蛋白活性

*多種規(guī)模蛋白發(fā)酵模式：小規(guī)模（500ml，2.5L，10L和30L）、大規(guī)模（80L,130L,250L和500L發(fā)酵罐）

*短時間內(nèi)制備高純度毫克級，克級重組蛋白

*低內(nèi)毒素：LAL檢測法<0.1EU/mg

*完整的GMP文件支撐體系，服務中所有材料、試劑和制備信息可追溯

卡梅德生物科技（天津）有限公司真誠期待與您的合作！