SIGMA P215-1MG  PD 98059; P215-5MG

五洲元業(yè)特別提醒：注意該試劑現(xiàn)用現(xiàn)配，否則會有結(jié)晶析出。

采用Ficoll-Paque淋巴細胞分離液分離成人MSC ,體外擴增 ,應(yīng)用地塞米松、β -甘油磷酸鈉、vitaminC定向誘導(dǎo)MSC分化為成骨細胞。在成骨誘導(dǎo)液中加入不同劑量的PD980 59,觀察其對成骨細胞形成的影響。結(jié)果 :MSC體外擴增 1 5代可獲得 (3 - 4 )× 1 0 1 2 個細胞。

目的 :探討胞外信號調(diào)節(jié)激酶 (ERK)信號傳導(dǎo)途徑對骨髓間質(zhì)干細胞 (MSC)分化為成骨細胞的影響。方法 :采用Ficoll-Paque淋巴細胞分離液分離成人MSC ,體外擴增 ,應(yīng)用地塞米松、β -甘油磷酸鈉、vitaminC定向誘導(dǎo)MSC分化為成骨細胞。在成骨誘導(dǎo)液中加入不同劑量的PD980 59,觀察其對成骨細胞形成的影響。結(jié)果 :MSC體外擴增 1 5代可獲得 (3 - 4 )× 1 0 1 2 個細胞。在成骨誘導(dǎo)液作用下 ,MSC可在體外定向分化為成骨細胞。不同劑量的PD980 59均可抑制MSC分化為成骨細胞 ,并有劑量依賴關(guān)系 ;同時促使部分細胞轉(zhuǎn)化為脂肪細胞。結(jié)論 :ERK信

細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)級聯(lián)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路中的重要一員，與細胞增殖、分化、凋亡關(guān)系密切[1]。乙型肝炎病毒(HBV)x(HBx)基因是一種致肝癌的重要因子，能激活肝細胞內(nèi)ERK通路，從而影響細胞生物學(xué)特性[2，3]。本實驗通過穩(wěn)定表達HBx的HepG2細胞(HBx+ HepG2)對順鉑以及順鉑聯(lián)合MAPK/ERK激酶(MEK)特異性抑制劑PD98059敏感性差異的研究，探討PD98059提高HBx+HepG2對順鉑敏感性的作用機制。
一、材料與方法
1. 質(zhì)粒、細菌及細胞株：質(zhì)粒pCP10由北京解放軍第三0二醫(yī)院傳染病研究所成軍教授惠贈，內(nèi)含兩拷貝的HBV ayw亞型全長基因組序列；pcDNA3真核表達載體購于美國Stratagene公司；感受態(tài)菌株由鄭州大學(xué)消化疾病研究所自制；人肝癌細胞株HepG2購于中國科學(xué)院上海細胞生物研究所；宿主菌E.coli JM109由鄭州大學(xué)消化疾病研究所保存。
2. 主要試劑：質(zhì)粒抽提試劑盒、凝膠純化試劑盒為美國Promega公司產(chǎn)品；核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ購自大連寶生物公司；轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine plus為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；超純質(zhì)粒抽提試劑盒購自武漢Vata-gene公司；RNA抽提試劑盒為德國Qiagen公司產(chǎn)品；鼠抗人單克隆抗體p-ERK1/2、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)均購自北京中山生物技術(shù)有限公司；PD98059為美國Sigma公司產(chǎn)品。引物合成和DNA測序分別由上海生工生物工程公司、北京賽百勝生物技術(shù)公司完成。
3. 引物設(shè)計：應(yīng)用Oligo引物設(shè)計軟件，以HBx基因的開放讀碼框(ORF)為目的片段設(shè)計巢式聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物，于內(nèi)引物5′端分別加入EcoRⅠ、HindⅢ酶切位點及保護堿基，其引物序列上游：5′-CGGAAGCTTATGGCTGCT AGGCTGTGCTG-3′，下游：5′-CGGAATTCTTAGGCA GAGGTGAAAAAGT-3′，擴增產(chǎn)物長度482bp；外引物序列上游：5′-TGCGTTGATGCCTTTGTATG-3′，下游：5′-AGAATTGCTTGCCTGAGTGC-3′，擴增產(chǎn)物長度1034bp。
4. 載體的構(gòu)建和鑒定：將HBx的PCR擴增產(chǎn)物和pcDNA3均進行EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切，目的片段行凝膠回收，載體和靶片段(1:5)用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，小量制備表達載體pcDNA3-HBx。將重組質(zhì)粒進行EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的片段是否存在，并將重組質(zhì)粒進行DNA測序。
5. 質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)染和陽性細胞的篩選：轉(zhuǎn)染前1d于24孔板中接種約70%孔底面積的HepG2，24h后轉(zhuǎn)染，同時設(shè)空質(zhì)粒組和脂質(zhì)體組。含G418培養(yǎng)基篩選陽性克隆，以500μg/ml的濃度篩選2周，待對照組細胞全部死亡后，將濃度降至200μg/ml維持篩選。挑取陽性克隆擴大培養(yǎng)，抽提細胞RNA進行RT-PCR，鑒定HBx-ORF是否存在。
6. Western blot檢測各組細胞中磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的表達情況：收集1×107個細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，4℃ 12000r/min離心5min，收集沉淀。加入預(yù)冷的裂解液30μl，吹打均勻，4℃ 10 000r/min離心2min，吸上清液準備上樣或-80℃保存。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)印于聚偏氟乙烯膜上。封閉液室溫封閉1h；分別加入抗體(1:100)與第二抗體(1:1000)，37℃孵育1h；DAB顯色。
7. 四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞對順鉑的敏感性：分別將陽性組細胞、空質(zhì)粒組細胞、脂質(zhì)體組細胞消化為單細胞懸液，以1×104/孔接種于96孔板，待其完全貼壁后，先用無血清、無抗菌素培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜使其同步化。然后每孔加入含2μg/ml順鉑的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24h。陽性細胞另設(shè)一組，在加入順鉑前，先用含100μmol/L PD98059的培養(yǎng)基孵育2h，再加入相同濃度順鉑進行孵育。每組均設(shè)正常對照及空白對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24h，按MTT法測530nm處吸光度值(A)。抑制率(IR)=(1－加藥孔A值/對照孔A值)×100%。
8. 統(tǒng)計學(xué)分析：用SPSS10.0軟件進行單因素方差分析。
二、結(jié)果
1. 表達載體的鑒定：對pcDNA3-HBx行雙酶切，得到含粘性末端的HBx-ORF片段，長475bp(圖1)。測序結(jié)果顯示，插入片段與質(zhì)粒中HBx-ORF基因100%同源。
2. 轉(zhuǎn)基因細胞的篩選：對轉(zhuǎn)染pcDNA3-HBx的HepG2經(jīng)G418篩選3～4周后分別挑選抗性克隆，RT-PCR檢測HBx-ORF mRNA。結(jié)果顯示陽性細胞中存在目的片段，長485bp(圖2)。
3. 各組細胞p-ERK1/2的表達：HBx+細胞p-ERK1/2的表達明顯強于空質(zhì)粒組細胞和脂質(zhì)體組細胞(ERK1為4.4×104，ERK2為4.2×104)，見圖3。
4. 各組細胞對順鉑的敏感性：順鉑對HBx+細胞抑制率明顯低于空質(zhì)粒組和脂質(zhì)體組(P<0.01)。而先用PD98059孵育的HBx+細胞，順鉑對其抑制率顯著上升(表1)。
表1  順鉑對各組細胞的抑制率(x-±s)
組別 樣本數(shù)  抑制率(%)
脂質(zhì)體組 9 32.51±2.49*
空載體組 9 30.18±3.24*
HBx+組 9 20.23±1.98
PD98059組 9 31.20±3.26*
　　與HBx+組相比，* P<0.01
三、討論
ERK1/2通過其上游的激酶MEK1/2，及其激酶的激酶Raf逐級磷酸化，最終激活自身的蘇氨酸、酪氨酸激酶而活化[4]。激活的ERK移位到細胞核，磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，從而激活一些基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細胞增殖和抑制細胞凋亡，其最終結(jié)果與腫瘤的惡性演變相關(guān)[5，6]。
X蛋白(pX)是HBV 4個ORF中X-ORF編碼的一種病毒蛋白，是誘發(fā)肝細胞癌的重要因子。研究發(fā)現(xiàn)，能被pX激活的轉(zhuǎn)錄因子有核因子-κB、AP-1、AP-2和SP-1等，而pX是通過激活ERKs、JNKs、MAP和Ras-Raf-MAP等酶聯(lián)信號系統(tǒng)來激活轉(zhuǎn)錄因子的表達。癌基因和原癌基因被激活后，可激發(fā)相應(yīng)的致癌效應(yīng)。
本實驗通過對穩(wěn)定表達HBx的HepG2細胞的研究，發(fā)現(xiàn)HBx可以激活細胞內(nèi)的ERK通路，從而降低HepG2對順鉑的敏感性。而以PD98059阻斷ERK的激活之后，HBx+ HepG2對順鉑的敏感性恢復(fù)至正常HepG2的水平。從而為確定一個肝癌輔助治療靶點，提高乙型肝炎后肝癌化學(xué)治療的效果提供理論基礎(chǔ)。