【產(chǎn)品用途】本產(chǎn)品可應(yīng)用于核酸RNA 的快速擴(kuò)增，采用通用型核酸檢測(cè)試紙條進(jìn)行檢測(cè)。

【檢測(cè)原理】本產(chǎn)品是基于重組酶介導(dǎo)鏈置換核酸擴(kuò)增（Recombinase-aid Amplification，RAA）技術(shù)開(kāi)發(fā)的恒溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑，在 42℃恒溫條件下特異識(shí)別并擴(kuò)增目標(biāo)樣本的RNA片段，用通用型核酸檢測(cè)試紙條檢測(cè)判斷。

【技術(shù)原理】重組酶介導(dǎo)鏈置換核酸擴(kuò)增（Recombinase-aid Amplification，RAA），是一種恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)。RT-RAA先利用逆轉(zhuǎn)錄酶將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，從細(xì)菌或真菌中獲得的重組酶在常溫下可與引物DNA緊密結(jié)合，形成重組酶/引物復(fù)合體，侵入RNA-cDNA雙鏈核酸模板，在侵入位點(diǎn)重組酶將雙鏈打開(kāi)，同時(shí)單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合到被重組酶打開(kāi)的單鏈上，維持雙鏈模板處于開(kāi)鏈狀態(tài)。重組酶/引物復(fù)合體開(kāi)始對(duì)雙鏈進(jìn)行掃描，當(dāng)引物在模板上搜索到與之完全匹配的互補(bǔ)序列時(shí)，重組酶/引物復(fù)合體解體，DNA聚合酶結(jié)合到引物的3’端，開(kāi)始合成新鏈。合成的新鏈又可以作為模板，最終擴(kuò)增產(chǎn)物以指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，完成靶標(biāo)基因的擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)熒光標(biāo)記的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，當(dāng)探針被核酸內(nèi)切酶酶切后，與生物素標(biāo)記的引物共同擴(kuò)增形成兩端有熒光標(biāo)記及生物素標(biāo)記的片段，可用通用型核酸檢測(cè)試紙條進(jìn)行判讀。如下圖所示： 

本試劑盒具有快速、靈敏度高以及特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，反應(yīng)組分已混合并冷凍干燥成反應(yīng)干粉，操作簡(jiǎn)便，易于保存。

【引物設(shè)計(jì)與探針設(shè)計(jì)】

引物設(shè)計(jì)建議方法：RAA核酸擴(kuò)增技術(shù)對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求與常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì)有一定的區(qū)別。由兩條寡核苷酸組成一對(duì)引物，分別特異性識(shí)別一個(gè)核酸目標(biāo)物的上下游核苷酸序列；引物長(zhǎng)度在30-35nt之間，序列中無(wú)回文序列、連續(xù)單堿基重復(fù)序列和內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)；引物Tm值不作為設(shè)計(jì)時(shí)主要考慮因素；最佳引物對(duì)需通過(guò)試驗(yàn)優(yōu)化篩選得到，要求其擴(kuò)增產(chǎn)物為單一條帶，無(wú)非特異性擴(kuò)增和明顯的引物二聚體。同時(shí)RAA-nfo 的下游引物 5’端用一種抗原標(biāo)記物標(biāo)記，通常為生物素。

探針設(shè)計(jì)建議方法：探針序列不與引物識(shí)別位點(diǎn)重疊，長(zhǎng)度在46-52 nt之間，序列避免回文序列、內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基；探針的5’端用一種抗原標(biāo)記物標(biāo)記，通常為FAM基團(tuán)或羧基熒光素；內(nèi)部含有堿基核苷酸類(lèi)似物替換核苷酸（例如四氫呋喃殘基THF-有時(shí)稱(chēng)為'dSpacer'）；3’末端有聚合酶延伸阻斷基團(tuán)（例如C3-spacer，磷酸基或雙脫氧核苷酸）。如下圖所示  

建議：在開(kāi)展 RT-RAA-nfo（試紙條型）擴(kuò)增反應(yīng)之前，先進(jìn)行引物的篩選試驗(yàn)，以便得到較高的檢測(cè)靈敏度。

【產(chǎn)品組成】

【儲(chǔ)存條件及有效期】本產(chǎn)品存儲(chǔ)于-20±5℃、干燥、避光條件下；有效期為12 個(gè)月。

【檢測(cè)步驟】

1. RNA樣本提?。?/span>請(qǐng)參考傳統(tǒng) Trizol 方法或其他同效商品化試劑盒提取RNA樣本。

2. 樣本檢測(cè)

2.1 單管反應(yīng)體系（50μL）：                    推薦反應(yīng)體系（模板用量為5μL）：  

反應(yīng)干粉          1 管                          反應(yīng)干粉          1 管           

A Buffer          25 μL                        A Buffer          25 μL           

上游引物(2μM)    2.0 μL                       上游引物(2μM)    2.0 μL           

下游引物(2μM)    2.0 μL                       下游引物(2μM)    2.0 μL                 

探針(2μM)        0.6 μL                        探針(2μM)        0.6 μL

RNA樣本和水      17.9μL                        水               12.9 μL        

B Buffer          2.5μL                        RNA樣本          5 μL           

B Buffer          2.5μL 

 總體積         50.0μL           

總體積          50.0μL                                               

2.2 操作步驟

2.2.1 根據(jù)反應(yīng)數(shù)量，按照反應(yīng)體系配制含有水、A Buffer、上游引物(2μM)、下游引物(2μM) 、探針（2μM）的Mix，混合均勻后加入裝有反應(yīng)干粉的檢測(cè)單元管中；

2.2.2 向檢測(cè)單元管中加入經(jīng)步驟1處理得到的待測(cè)RNA樣本；

2.2.3 再向檢測(cè)單元管蓋上加入2.5 μL 的B Buffer，蓋上管蓋，上下顛倒輕甩混勻5-6次，低速離心10 sec；（注：本步驟“是否充分混勻”將決定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性）

2.2.4 將檢測(cè)單元管放入42℃恒溫金屬浴（或恒溫水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱等）中，孵育30min。

2.2.5 反應(yīng)結(jié)束后，將50μL反應(yīng)體系液用無(wú)菌水或者PBS稀釋?zhuān)?0μL反應(yīng)體系液:300μL稀釋劑），利用通用型核酸檢測(cè)試紙條進(jìn)行檢測(cè)。推薦使用免開(kāi)蓋的裝置進(jìn)行試紙條檢測(cè)，避免氣溶膠污染。

【結(jié)果分析與判定】利用通用型核酸檢測(cè)試紙條進(jìn)行結(jié)果判定。

【注意事項(xiàng)】

1. 在同一核酸提取方法下，不同樣品類(lèi)型所提取的核酸含量和純度會(huì)有明顯差異，導(dǎo)致擴(kuò)增效率不同；

2. 當(dāng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、試劑、儀器或配件存在陽(yáng)性物質(zhì)（例如質(zhì)粒、擴(kuò)增產(chǎn)物等）污染，或樣本間存在交叉污染的情況，則會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；

3. 務(wù)必保證試劑保存、配制或運(yùn)輸?shù)卯?dāng)，否則可能導(dǎo)致試劑檢測(cè)性能下降，出現(xiàn)假陰性結(jié)果；

4. 請(qǐng)嚴(yán)格按照本說(shuō)明書(shū)和基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范進(jìn)行試驗(yàn)操作；

5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，檢測(cè)過(guò)程中所產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)按照相關(guān)規(guī)范進(jìn)行處理。

相關(guān)產(chǎn)品：