【嘉美生物】In situ cell death detection kit-POD法

一、 原理：
TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素（fluorescein）標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的熒光素抗體特異性結(jié)合，后者又與HRP底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）反應產(chǎn)生很強的顏色反應（呈深棕色），特異準確地定位正在凋亡的細胞，因而在光學顯微鏡下即可觀察凋亡細胞；由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3‘-OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞涂片）在單細胞水平上的凋亡原位檢測。還可應用于抗腫瘤藥的藥效評價，以及通過雙色法確定細胞死亡類型和分化階段。

二、 器材與試劑
器材：光學顯微鏡及其成像系統(tǒng)、小型染色缸、濕盒（塑料飯盒與紗布）、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規(guī)格的加樣器及槍頭等；
試劑：試劑盒含TdT 10×、熒光素標記的dUTP 1×、標記熒光素抗體的HRP；自備試劑：PBS、雙蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（臨用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8）或細胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，臨用前配制）、蘇木素或甲基綠、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。

三、 實驗步驟
操作流程圖：制作石蠟切片→脫蠟、水合→細胞通透→加TUNEL反應液→加converter-POD→與底物DAB反應顯色→光學顯微鏡計數(shù)并拍照。
具體操作步驟（石蠟包埋切片的檢測）：
1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min；
2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；
注：上面兩步是針對石蠟切片樣本的處理
4. 用Proteinase K工作液處理組織15-30 min 在21–37°C（溫度、時間、濃度均需摸索）或者加細胞通透液8min；
5. PBS漂洗2次；
6. 制備TUNEL反應混合液，處理組用50μl TdT+450μl 熒光素標記的dUTP液混勻；而陰性對照組僅加50μl 熒光素標記的dUTP液，陽性對照組先加入100μl DNase 1，反應在15~25℃×10min，后面步驟同處理組。
7. 玻片干后，加50μl TUNEL反應混合液（陰性對照組僅加50μl 熒光素標記的dUTP液）于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×1h。
8. PBS漂洗3次；
9. 可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計數(shù)凋亡細胞（激發(fā)光波長為450~500nm，檢測波長為515~565nm）；
10. 玻片干后加50μl converter-POD于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×30min。
11. PBS漂洗3次；
12. 在組織處加50~100μlDAB底物，反應15~25℃×10min；
13. PBS漂洗3次；
14. 拍照后再用蘇木素或甲基綠復染，幾秒后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。
15. 加一滴PBS或甘油在視野下，用光學顯微鏡觀察凋亡細胞（共計200~500個細胞）并拍照?？山Y(jié)合凋亡細胞形態(tài)特征來綜合判斷（未染色細胞變小，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)凋亡小體，貼壁細胞出現(xiàn)鄒縮、變圓、脫落；而染色細胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體）
對于培養(yǎng)細胞的預處理：
①在載玻片上鋪一層薄薄的多聚賴氨酸（見備注4），干燥后在去離子水中漂洗，干燥后4℃保存；
②適當方法誘導細胞凋亡，同時設未經(jīng)誘導的對照組，各組離心收集約1×106個細胞，PBS洗一次，重懸，加到鋪好的多聚賴氨酸載玻片上，自然干燥，使細胞很好的吸附到載玻片上；
③將吸附細胞的載玻片在4%多聚甲醛（見備注2）中固定25min；
④PBS浸洗二次，每次5min；
⑤將吸附細胞的載玻片在0.2%的Triton X-100（見備注5）中處理5min；
⑥PBS浸洗二次，每次5min；
后續(xù)操作如同石蠟包埋切片的6—15

四、 注意事項
1. 進行PBS 清洗時，每次清洗5 min。
2. PBS清洗后，為了各種反應的有效進行，請盡量除去PBS 溶液后再進行下一步反應。
3. 在載玻片上的樣本上加上實驗用反應液后，請蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進行，這樣可以使反應液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應液干燥造成實驗失敗。
4. TUNEL反應液臨用前配制，短時間在冰上保存。不宜長期保存，長期保存會導酶活性的失活。
5. 如果20×DAB 溶液顏色變深成為紫色，則不可使用，需重新配制。
6. 用甲基綠（Methyl Green）染液（3-5%甲基綠溶于0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0）染色后，請用滅菌蒸餾水清洗多余的甲基綠。然后進行洗凈（100%乙醇）、脫水（二甲苯）透明、封片后通過光學顯微鏡觀察操作。如果此時使用80~90%的乙醇洗凈時，甲基綠比較容易脫色，注意快速進行脫水操作。
7. 熒光素標記的dUTP液含甲次砷酸鹽和二氯鈷等致癌物，可通過吸入、口服等途徑進入機體，注意防護。
8. 試劑保存；未打開的試劑盒貯存在-20℃（-15~25℃）；converter -POD液一旦解凍，以后就保存在4℃（2~8℃）下，至少在6 m內(nèi)穩(wěn)定，避免再次凍存；TUNEL反應液臨用前配好后，放至冰上直至使用。
9. 結(jié)果分析時注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細胞中可產(chǎn)生大量DNA片斷，從而引起假陽性結(jié)果；而有些類型的凋亡性細胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不完全，以及細胞外的矩陣成分阻止TdT進入胞內(nèi)反應，進而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

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