豬偽狂犬病毒野毒株（gE基因）探針法熒光定量PCR試劑盒Pseudorabies Virus（PrV）的特點(diǎn)

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，不會跟其他病毒的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研。

包裝規(guī)格及成份（具體信息詳見説明書，以説明書為準(zhǔn)）

豬偽狂犬病毒野毒株（gE基因）探針法熒光定量PCR試劑盒Pseudorabies Virus（PrV）使用方法

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，

千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，

只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備

7. 如果有N個樣品，最好設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL陽性對照的10000倍稀釋

液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。

8. 用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。也以選購本公司的柱式病毒RNAout。本試劑盒免費(fèi)贈送20次免RNA提取

的核酸釋放劑試用裝，該釋放劑的裂解液可以直接作為RT-PCR模板，省略了RNA提取步驟。

三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個PCR 管，其中N+2個用于上步得到的 N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。

如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4 個PCR管，

其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），

1個用于PCR陽性對照（用第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存

好后最后加）：

成分	樣品管N+2個	RT-PCR陰性對照管	標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管 （2-7 管）
探針法qPCR緩沖液	各 10 μL	10 μL	各 10 μL
探針法 qPCR 酶混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
qRT-PCR探針	各 1 μL	1 μL	各 1 μL
探針qRT-PCR 引物混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
待測樣品 RNA 模板	各 5 μL	--	--
超純水	--	5 μL	--
第 7 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（2-7 號）	--	--	各5 μL（2號樣到2號管，3號樣到3 號管…）

1. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 qRT-PCR：

過程	溫度	時間
逆轉(zhuǎn)錄	50℃	30 min
預(yù)變性	94℃	10 min
qRT-PCR 反應(yīng)（40 個循環(huán)）	94℃	15 sec
	60℃	1 min（采集 FAM 通道的熒光信號）

四、數(shù)據(jù)處理

11.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品核酸濃度的log值，再推算出其濃度。

12.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于39。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于39則為陽性。如果在39-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。

豬偽狂犬病毒野毒株（gE基因）探針法熒光定量PCR試劑盒Pseudorabies Virus（PrV）【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存

有效期 12 個月。

豬偽狂犬病毒野毒株（gE基因）探針法熒光定量PCR試劑盒Pseudorabies Virus（PrV）注意事項

1操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

2試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完全混勻并短暫離心；

3反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

7實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進(jìn)行處理。

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