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本品產僅供科研

產品名稱：禽正呼腸孤病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒Avian Orthoreovirus

產品規(guī)格：50次/盒

本產品是以染料法熒光定量PCR技術為基礎開發(fā)的PCR試劑盒，它具有下列特點：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。

2.引物等組分經過優(yōu)化，靈敏度高。

3.提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據高度保守區(qū)設計，不會跟其他的DNA/RNA發(fā)生交叉反應。

5.既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數量級。

6.本產品足夠50次20μL體系的染料法熒光定量PCR反應。

7. 本產品只能用于科研

禽正呼腸孤病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒Avian Orthoreovirus操作方法一、制備標準曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，

千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，

只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。

1.標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

2.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.在7號管中加入5 μL 陽性對照（其濃度為1×10E8拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

1.用自選方法純化樣品的DNA，本產品跟市場上絕大多數核酸純化產品兼容。

2.如果有N個樣品，則需要進行N+2個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。

三、設置qPCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）

如果進行定量分析，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標準曲線樣品。

如果做定性分析，則6個標準曲線樣品只選一個做（可以選4號，其余樣品不變）。以下只介紹定量分析的反應設置。

四、數據處理

1.通過溶解曲線分析的結果排除無效數據。有Ct值，但Tm值跟陽性對照Tm不一樣的樣品(包括對照和待測樣品)，歸為假陽性，數據無效，不予以分析。Tm跟陽性對照Tm一致的，為有效Ct。

2.如果兩種陰性對照的溶解曲線所得Tm值跟陽性對照的Tm值一樣，說明環(huán)境或試劑可能有過去的PCR擴增產物污染，則此次實驗無效，需要解決污染問題再進行實驗。

3.如果兩種陰性對照(樣品制備陰性對照和PCR陰性對照)是假陽性，可以繼續(xù)分析其它樣品有效數據。

4.對定量檢測，以陽性對照樣品的濃度的log值為橫軸，以有效Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的有效Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再換算出待測樣品的DNA濃度。

5.對定性檢測，則有有效Ct值的為陽性，無有效Ct值的為陰性。

禽正呼腸孤病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒Avian Orthoreovirus樣本采集、存放及運輸：

1、樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集；

2、運輸及保存：低溫運輸，-20℃保存，保存期限一年。陽性對照需單獨放置，不要污染其他試劑。

3、運輸：采用泡沫箱加冰密封進行運輸。

4、自備試劑：樣品DNA。

禽正呼腸孤病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒Avian Orthoreovirus注意事項

1所有操作嚴格按照說明書進行

2試劑盒內各種組分使用前應自然融化，混勻并短暫離心；

3 反應液應避光保存；

4反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

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