Glufosinate Ammonium草銨膦【bar/pat轉(zhuǎn)基因篩選標(biāo)記】

搜索關(guān)鍵詞：

除草劑；轉(zhuǎn)基因植物篩選標(biāo)記；農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化；草丁膦（phosphinothricin，PPT）；雙丙氨膦（Bialaphos）；bar基因；pat基因；草銨膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶；谷氨酰胺合成酶（GS）；CAS：77182-82-2；

除草機制：

草銨膦（Glufosinate Ammonium，CAS：77182-82-2），也稱為草丁膦（phosphinothricin，PPT），是D-和L-草丁膦組成的外消旋混合物。L-草丁膦是一種天然來源的細(xì)菌氨基酸，也是一種低毒性、高活性且廣譜的非選擇性除草劑。作為谷氨酸的結(jié)構(gòu)類似物，不可逆競爭抑制谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）活性，破壞GS參與的多方代謝活動，最終導(dǎo)致植物死亡，這些代謝作用包括：1）干擾谷氨酰胺合成，導(dǎo)致機體無法進行氨解毒，氨的積累造成細(xì)胞膜破壞；2）導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨基作用和轉(zhuǎn)?；餍枰挠袡C氮供體缺乏，降低肽，蛋白質(zhì)和核苷酸生物合成；3）促使蛋白質(zhì)降解；4）抑制光合作用，破壞光呼吸途徑，永久傷害光合作用器。

植物基因工程研究（篩選標(biāo)志）作用機理：

植物基因工程研究，草銨膦（草丁膦，PPT）常常用作一種選擇性標(biāo)記來篩選攜帶草銨膦抗性基因的轉(zhuǎn)基因植物。目前使用的有來自不同鏈霉菌的bar（bialophos resistance）基因和pat（phosphinothricin-acetyl transferase）基因，它們都可編碼草丁膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（phosphinothricin N-acetyltransferase），使其轉(zhuǎn)化成為一種無GS抑制活性的化合物。

基本特性：

1. CAS NO：77182-82-2
2. 同義名：2-Amino-4-(hydroxymethylphosphinyl)butyric acid ammonium salt 2-氨基-4-[羥基(甲基)膦?；鵠丁酸 銨鹽；DL-Phosphinothricin DL-草丁膦；草丁膦；Basta^®；DL-草銨膦；
3. 分子式：C₅H₁₁NO₄P • NH₄
4. 分子量：198.16 g/mol
5. 外觀：白色至黃白色粉末
6. 熔點：209-215 °C
7.  溶解性：易溶于水
8. 純度：≥95%

應(yīng)用案例【轉(zhuǎn)基因的小麥幼胚/愈傷組織篩選】（僅作參考）：

1. 使用草銨膦（PPT）或雙丙氨膦進行轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選；
2. 粒子轟擊（bombardment）后將未成熟幼胚逐個轉(zhuǎn)移到E3培養(yǎng)基，維持培養(yǎng)7-14天；
3. 胚胎轉(zhuǎn)移到含5µg/ml PPT（或雙丙氨膦）的MSCB5培養(yǎng)基（輪篩選用培養(yǎng)基），黑暗培養(yǎng)2周；于這2周內(nèi)不能正常生長的愈傷組織直接扔棄。
4. 用解剖刀將在MSCB5培養(yǎng)基上增殖的細(xì)胞簇解離，亞克隆，轉(zhuǎn)移到含有10 µg/ml PPT（或雙丙氨膦）的MSCB10培養(yǎng)基，維持培養(yǎng)4周。
5. 在含5µg/ml或10µg/ml PPT（或雙丙氨膦）的培養(yǎng)基上篩選過程的持續(xù)周期約為50-75天。將所有培養(yǎng)物放到植物生長培養(yǎng)箱內(nèi)，設(shè)置25 °C，黑暗培養(yǎng)。每一個轉(zhuǎn)基因愈傷組織在含有篩選標(biāo)志的培養(yǎng)基上最終生長為大量的胚性愈傷組織。
6. 設(shè)置1-10µg/ml PPT（或雙丙氨膦）的梯度濃度來測試未轉(zhuǎn)化愈傷組織，以建立更加有效的篩選系統(tǒng)。每一次實驗大概準(zhǔn)備20個目標(biāo)培養(yǎng)平板。2個為對照，1個在N6C1上生長以監(jiān)測培養(yǎng)物的健康情況，另1個在含5-10µg/ml雙丙氨膦的N6C1上生長以驗證未轉(zhuǎn)化細(xì)胞對選擇標(biāo)志的反應(yīng)。

【注意】：轉(zhuǎn)基因小麥愈傷組織的選擇實驗中雙丙氨膦是有效的篩選標(biāo)志，然而雙丙氨膦不能殺死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞。為了得到理想的篩選效果，建議低密度（大概每個平板上10個未成熟幼胚）亞培養(yǎng)粒子轟擊后的細(xì)胞。

草銨膦（PPT）除草對象和劑量：

用于果園、葡萄園、非耕地防除一年生和多年生雙子葉及禾本科雜草，以5～6L/ha施用，可防除鼠尾看麥娘、馬唐、稗、野大麥、多花黑麥草、狗尾草、金狗尾草、野小麥、野玉米；多年生禾本科和莎草科雜草，如鴨茅、曲芒發(fā)草、羊茅、絨毛草、黑麥草、雙穗雀稗、蘆葦、早熟禾；3～5L/ha可防除野燕麥、雀麥、早熟禾、辣子草、豬殃殃、寶蓋草、小野芝麻、龍葵、繁縷、田野勿忘草等；7.5～10L/ha可防除匍匐冰草、匍匐剪股穎、拂子茅、苔草、狗牙根、反枝莧等；防除闊葉雜草應(yīng)在旺盛生長始期施藥，防除禾本科雜草應(yīng)在分蘗始期施藥；以1.52～20kg/ha防除森林和高山牧場的懸鉤子和蕨類植物。

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注意事項

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】
 

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