中文名：牛痘病毒加帽酶

英文名：Vaccinia Capping Enzyme

純度：醫(yī)藥級(jí)

貨號(hào)：V406454

包裝：500u

存儲(chǔ)溫度：-20°C儲(chǔ)存

產(chǎn)品介紹：

產(chǎn)品基本信息

來源：攜帶牛痘病毒加帽酶基因的E.coli

反應(yīng)條件：1x Capping Buffer (50 mM Tnis-HC1, pH 8.0; 5 mM KC1; 1 mMMgaly; 1 mM DTT). 37℃孵有

儲(chǔ)存緩沖液：20mM Tnis-HC1 pH8.0;100mMNaC1; 1mM DTT; 0.1mMEDIA;0.1%TritonX-100;50% (wv) Glycerol

產(chǎn)品描述

體外轉(zhuǎn)錄獲得的mRNA未經(jīng)細(xì)胞內(nèi)一系列修飾，不具備Cap 結(jié)構(gòu)與PolyA 尾，容易降解，易激活免疫反應(yīng)，不能與核糖體起始蛋白結(jié)合，無法啟動(dòng)蛋白翻譯，因而在工業(yè)化mRNA生產(chǎn)中，需使用牛痘病毒加帽酶對(duì)IVT 的mRNA進(jìn)行加帽修飾，使mRNA的5' 端獲得Cap0 結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步使用2'-O- 甲基轉(zhuǎn)移酶將Cap0 轉(zhuǎn)化為Cap1。酶法加帽引入的帽結(jié)構(gòu)與真核生物體內(nèi)天然帽結(jié)構(gòu)完全一致，從根本上降低外源mRNA 免疫原性的同時(shí)，保護(hù)其不被降解，并提高翻譯效率，增加細(xì)胞內(nèi)蛋白產(chǎn)量。通過酶法加帽最大可獲得100%的加帽效率，而通過化學(xué)合成帽類似物結(jié)構(gòu)加帽，其加帽效率相對(duì)較低，并且帽類似物結(jié)構(gòu)與天然帽結(jié)構(gòu)有差異。

牛痘病毒加帽酶將 7-甲基鳥苷帽結(jié)構(gòu)（m7Gppp，Cap0）加到 RNA 的 5′ 末端。在真核生物中，該結(jié)構(gòu)與 mRNA 的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯密切相關(guān)。通過酶促反應(yīng)為 RNA 加帽是一種簡單有效的方法，能顯著改善用于體外轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)染和顯微注射的RNA的穩(wěn)定性和翻譯能力。這種酶由兩個(gè)亞基（D1 和 D12）組成 （圖 1a），D1 亞基執(zhí)行 RNA 三磷酸酶和鳥苷轉(zhuǎn)移酶的功能，D12亞基執(zhí)行鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶的功能，它們對(duì)于添加一個(gè)完整的 Cap0 結(jié)構(gòu) m7Gppp5′N 都是必須的（圖 1b）。?

本制品可用于 T7 RNA Polymerase, GMP Grade（GMP-E121，Novoprotein）反應(yīng)產(chǎn)生的 RNA 的加帽反應(yīng)，加帽反應(yīng)在一小時(shí)之內(nèi)完成，效率接近 100%，并且保證正確的方向。?

重組牛痘病毒加帽酶利用大腸桿菌大規(guī)模發(fā)酵表達(dá)，采用藥用規(guī)格原輔料生產(chǎn)，并嚴(yán)格控制宿主蛋白質(zhì)殘留、核酸殘留等，符合 GMP 規(guī)范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規(guī)程保障生產(chǎn)過程及所有原輔料可追溯。

圖1. 牛痘病毒加帽的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理。a. 牛痘病毒加帽酶和 GTP（紅色）、SAH（玫紅）的共結(jié)晶結(jié)構(gòu) (PDB 4CKB) 。該酶由 D1 和 D12 兩個(gè)亞基組成，兼具 RNA 三磷酸酶（藍(lán)色）、鳥苷轉(zhuǎn)移酶（橙色）和鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（米黃色）的功能。本圖引自 Ramanathan, A., Robb, G. B., & Chan, S. H. (2016). mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Res 44(16), 7511–7526. b. mRNA 的帽結(jié)構(gòu)是由一個(gè)7-甲基鳥苷通過一個(gè) 5′–5′三磷酸酯橋連接到 mRNA 鏈的 5′核苷上組成。Cap-0 結(jié)構(gòu)由相鄰的 RNA 鏈通過三種酶的依次反應(yīng)形成。進(jìn)一步形成 cap-1 結(jié)構(gòu)需要 2-O 甲基轉(zhuǎn)移酶的參與，該修飾可以降低RNA 在體內(nèi)引起的細(xì)胞先天免疫反應(yīng)。本圖引自 Decroly, E., Ferron, F., Lescar, J. et al. (2012). Conventional and unconventional mechanisms for capping viral mRNA. Nat Rev Microbiol 10, 51–65。?

質(zhì)量要求

遵循以下規(guī)范生產(chǎn)

1. ISO 9001:2015, certified facility。

2. 《GMP 附錄-細(xì)胞治療產(chǎn)品》國家藥品監(jiān)督管理局。

3. 《人用基因治療總論-中國藥典 2020》國家藥典委。

4. USP Chapter <1043>, Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered Products 用于細(xì)胞治療，基因治療和組織工程產(chǎn)品中的輔料。

5. USP Chapter <92>, Growth Factors and Cytokines Used in Cell Therapy Manufacturing 細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)過程中細(xì)胞因子和生長因子。

6. Ph. Eur. General Chapter 5.2.12, Raw Materials of Biological Origin for the Production of Cell-based and Gene Therapy Medicinal Products 用于生產(chǎn)細(xì)胞或基因治療藥物的生物來源原料。

產(chǎn)品用途

體內(nèi)或體外翻譯前 mRNA 的加帽和 mRNA 的 5’末端標(biāo)記。?

應(yīng)用實(shí)例

完整mRNA在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GFP蛋白，加帽酶與帽類似物對(duì)比

注意事項(xiàng)

1. 用于加帽反應(yīng)的 RNA 在使用之前應(yīng)進(jìn)行純化并溶解于無核酸酶水。溶液中不能含有 EDTA 和鹽。

2. 在配置反應(yīng)體系時(shí)，可以加入 0.5 μl 的 RNase 抑制劑（GMP-E125，Novoprotein），同時(shí)去掉等體積的 RNase-free Water。?

3. 在與加帽酶反應(yīng)之前加熱 RNA 可以消除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 5′的二級(jí)結(jié)構(gòu)。如果轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的 5′端結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可以把加熱時(shí)間延長至10 分鐘。

4. SAM 在 pH 7–8, 37°C 條件下不穩(wěn)定，需要在反應(yīng)開始之前新鮮配置?？梢允孪扔?jì)算好 SAM 的用量，在反應(yīng)開始前把分裝的 32 mM 的儲(chǔ)備液稀釋成 2 mM 的工作液。為避免 SAM 降解，該工作液需要保存于冰上。

5. 如果已知轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的 5′端結(jié)構(gòu)復(fù)雜，反應(yīng)時(shí)間可延長至 60 分鐘以提高加帽效率。

6. 在標(biāo)記 5′端時(shí)，GTP 儲(chǔ)備液應(yīng)稀釋到 mRNA 濃度的 1–3 倍。

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