中文名：快速內(nèi)切酶SphI
英文名：LightNing? SphI
貨號(hào)：L397780
包裝：1kit
存儲(chǔ)溫度：-20°C儲(chǔ)存
產(chǎn)品介紹：
產(chǎn)品組成
| 貨號(hào) |
組分 |
規(guī)格 |
| L397780A-50μl |
LightNing? SphI |
50μl |
| L397780B-1ml |
10×CutOne? Buffer |
1ml |
| L397780C-1ml |
10×CutOne? Color Buffer |
1ml |
|
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
LightNing? 快速內(nèi)切酶是一系列經(jīng)過基因工程重組、能夠在 5~15 分鐘內(nèi)精確完成 DNA 切割的限制性內(nèi)切酶，適用于質(zhì)粒 DNA、 PCR 產(chǎn)物或基因組 DNA 等的快速酶切。LightNing? 快速內(nèi)切酶具有如下特點(diǎn)：5~15 分鐘內(nèi)即可完成酶切；共用一種酶切 Buffer，大大簡(jiǎn)化酶切反應(yīng)體系；良好的酶活冗余度，輕松應(yīng)對(duì)底物過量或困難模板酶切。此外，去磷酸化、連接試劑在 CutOne? 酶切 Buffer 中具有 100% 活性，支持一管化反應(yīng)，提升“酶切 - 修飾 - 連接” 的體驗(yàn)。
建議反應(yīng)條件
1× CutOne? 緩沖液；
37℃溫育；
參照“DNA 快速酶切流程”配制反應(yīng)體系。
失活條件
80℃溫育 20 min。
質(zhì)量控制
功能活性檢測(cè)：最適反應(yīng)溫度下，在 20 μl 反應(yīng)體系中，1 μl LightNing? SphI 能夠在 15 min 內(nèi)完全消化 1 μg λDNA。
超長時(shí)間溫育檢測(cè)：最適反應(yīng)溫度下，將 1 μl LightNing? SphI 與 1 μg λDNA 共同溫育 3 h，未檢測(cè)到其他核酸酶污染或星號(hào)活性引起的底物非特異性降解，延時(shí)酶切可能出現(xiàn)星號(hào)活性。
酶切 - 連接 - 再酶切檢測(cè)：最適反應(yīng)溫度下，使用 1 μl LightNing? SphI 消化底物，回收酶切產(chǎn)物。在 22℃下使用適量 Fast T4 DNA Ligase 可以將酶切產(chǎn)物重新連接。將連接產(chǎn)物再次回收后，使用相同的內(nèi)切酶可以重新切開連接產(chǎn)物。
非特異性內(nèi)切酶活性檢測(cè)：最適反應(yīng)溫度下，將 1 μl LightNing? SphI 與 1 μg 超螺旋質(zhì)粒 DNA 共同溫育 4h，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，質(zhì)粒 DNA 仍然處于超螺旋狀態(tài)。
藍(lán)白斑檢測(cè)：將含有單一 lacZα 基因的載體以 1 μl LightNing? SphI 消化，重新連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有對(duì)應(yīng)抗生素、IPTG 和 X-gal 的 LB 培養(yǎng)基平板上。連接正確的產(chǎn)物會(huì)生長出藍(lán)色菌落， 而連接錯(cuò)誤（即 DNA 末端切口不完整）的產(chǎn)物將得到白色菌落。對(duì) 于 LightNing? 系列限制酶而言，白色菌落比例應(yīng)小于 1%。
使用方法
1. DNA 快速酶切流程
① 在冰上按如下建議的加樣順序配制反應(yīng)體系：?
a. 本體系適用于經(jīng)過純化的 PCR 產(chǎn)物酶切。未純化的 PCR 產(chǎn)物具備一定的離子強(qiáng)度，10× CutOne? Buffer 加入量可適當(dāng)減少至 2 μl。但由于 DNA 聚合酶同時(shí)具有外切酶活性，會(huì)影響酶切產(chǎn)物，因此如下一步需進(jìn)行克隆等操作，建議酶切前對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化。
② 輕柔吸打或輕彈管壁以混勻（切勿渦旋），然后瞬時(shí)離心以收集掛壁液滴；
③ 37℃溫育 15 min（質(zhì)粒），或 15~30 min（PCR 產(chǎn)物），或 30~60 min（基因組 DNA）；
④ 80℃溫育 20 min 即可使酶失活，停止反應(yīng)（可選）。
2. 雙酶切或多酶切
① 每種快速內(nèi)切酶的用量為 1 μl，并根據(jù)需要適當(dāng)擴(kuò)大反應(yīng)體系；
② 所有快速內(nèi)切酶的體積總和不得超過總反應(yīng)體系的 1/10；
③ 如果所用的幾種快速內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同，應(yīng)先以最適溫度低的酶開始酶切，再添加最適溫度較高的酶，在其最適反應(yīng)溫度下進(jìn)行酶切反應(yīng)。
3. 適用于質(zhì)粒的擴(kuò)大反應(yīng)體系
注：如果總反應(yīng)體系大于 20 μl，應(yīng)適當(dāng)增加溫育時(shí)間，盡量使用水浴、金屬浴或沙浴。
不同 DNA 中的酶切位點(diǎn)數(shù)量
甲基化修飾影響
在不同反應(yīng)緩沖液中的活性
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關(guān)鍵字： 快速內(nèi)切酶SphI;LightNing? SphI
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