中文名：PMA（疊氮溴化丙錠）， 20 mM in water

英文名：PMA (propidium azide bromide), 20 mm in water

貨號：P598082

包裝：100μl

存儲溫度：避光,-20°C儲存

產(chǎn)品介紹：

PMA是一種高親和性的DNA結(jié)合染料，該染料本身具有微弱的熒光，但與核酸結(jié)合后可以發(fā)出更為明亮的熒光。它尤其與雙鏈DNA具有高親和性。PMA不具有細胞膜滲透性，因此可選擇性地修飾膜受損的死細胞的 DNA。PMA修飾的DNA經(jīng)藍光（~464 nm）光解后，PMA上的光反應(yīng)性疊氮基轉(zhuǎn)化為高反應(yīng)性氮烯自由基，與DNA結(jié)合位點附近的任何烴部分反應(yīng)形成穩(wěn)定的共價氮碳鍵，從而導(dǎo)致永久性 DNA 修飾（圖1）。該修飾過程會使DNA不溶，并使其在隨后的基因組DNA提取過程中與細胞碎片一起丟失，進而阻礙死細胞中目標DNA的PCR擴增。殘留在溶液中未結(jié)合的PMA，在強光照射下與水分子反應(yīng)分解成無交聯(lián)活性的羥胺化合物，使羥胺不再能夠共價結(jié)合DNA，從而不影響PCR擴增。這個特性使得 PMA 可以通過實時定量 PCR（qPCR）的手段，檢測多種樣本類型包括：細菌、生物膜、酵母、真菌、病毒和真核細胞；與qPCR、NGS、Sanger測序和LAMP技術(shù)相結(jié)合，廣泛應(yīng)用在食品和水安全和環(huán)境測試中。

產(chǎn)品參數(shù)：

橙紅色液體； Ex (pH 3) = 464 nm (before photolysis)； Ex /Em (after photocrosslinking to nucleic acid) = 510/610 nm

注意事項：

1. 使用前請將產(chǎn)品瞬時離心至管底，再進行后續(xù)實驗。 2. 試劑盒組分中含有熒光染料，使用及保存過程中注意避光。 3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

應(yīng)用范圍：

細菌核酸染色

使用方法：
使用前注意事項：
1. PMA 根據(jù)細胞膜通透性區(qū)分死菌和活菌。許多殺死細菌的方法會導(dǎo)致細胞膜受損，因此適用于 PMA 檢測。 但有些方法，如紫外線照射，可能不會立即導(dǎo)致細胞膜破裂。因此，在選擇 PMA 檢測之前，需先進行文獻檢索和預(yù)實驗確定是否適用于您選擇的細菌類型和殺傷方法。
2. PMA 處理完細菌后需要進行光解，以使染料與死細胞 DNA 共價結(jié)合。光解操作可以使用藍色或白色光源。一般來說，燈越亮，光解步驟的效率就越高。非 LED 燈（如鹵素?zé)簦┛赡軙訜崮臉颖静Ψ治霎a(chǎn)生負面影響，照射時需要使用冰塊對樣品降溫處理。
3. 樣本可以在光解后冷凍保存。若在進行 PMA 處理光解之前冷凍樣本可能會損壞細胞膜并產(chǎn)生假陰性結(jié)果。如需在檢測之前冷凍樣本，建議先進行預(yù)實驗。
4. PMA 的部分作用機制是通過沉淀從樣本中去除 PMA 共價修飾的 DNA；因此，在提取基因組 DNA 時，需使用相同體積的基因組 DNA 洗脫液，進行體積歸一化處理。陽性對照可以使用活細胞的基因組 DNA。
5. 為了驗證 PMA 在測試樣本中的有效性，可對比同處理樣本-/+PMA 之間的 Ct (dCt)變化。

實驗材料（自備）：
①光源（用于 PMA 修飾 DNA 后的光解步驟）；②細菌基因組 DNA 提取試劑盒；③配套的 qPCR Mix 試劑盒；④對應(yīng)樣本類型的有效 qPCR 引物；
實驗步驟：

1. 吸取 10 μL 菌液于液體 LB 培養(yǎng)基，在細菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜或更長時間，使細菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600 ≈ 1.0)；
注：培養(yǎng)基類型及培養(yǎng)時間根據(jù)實驗調(diào)整。
2. 取活細菌兩份，每份 400 μL，置于干凈離心管中。
3. （建議）制備死細菌。若需要死細菌作為對照，可將活細菌放入水浴鍋中 95℃加熱 5 min，或 58℃加熱 3 h，具體操作根據(jù)樣本類型自行選擇，即可獲得死細菌。死細菌的后續(xù)操作同活細菌。
4. 兩份活細菌，一份不用 PMA 處理，一份用 25 μM PMA 處理（處理不同類型或不同來源細菌的最適 PMA 濃度需查閱相關(guān)文獻）。
5. 將 PMA 處理的樣本室溫置于搖床上，避光孵育 10 min，使染料與樣本充分混勻。
6. 將樣品曝光，可以使用藍色或白色光源，照射時間需自行摸索。例如，可用 60 W 的藍光燈，照射 15 min。
注：① 若使用鹵素?zé)?，我們建議將 PMA 處理的樣本管放在距離光源 20 cm 處的冰塊上。冰塊應(yīng)放在透明托盤中，調(diào)整光源使其直接指向樣品，光解 5-15 min；② 若直接用環(huán)境中獲取的細菌進行實驗，由于環(huán)境樣本的復(fù)雜性或渾濁度，需適當(dāng)延長光解時間。

7. 處理和未處理的活細菌 5000 ×g，離心 10 min，去上清。
8. 根據(jù)樣本類型選擇合適的基因組 DNA 提取試劑盒，洗脫 DNA 時，各組樣本使用相同的洗脫體積。
注：DNA 提取步驟參考所用試劑盒的說明書。PMA 的部分作用機制是通過沉淀從樣品中去除 PMA 結(jié)合的 DNA；因此，在提取基因組 DNA 時，各組應(yīng)使用相同體積的基因組 DNA 洗脫液，進行體積歸一化處理（死菌和活菌提取基因組 DNA 量不一致，因此兩者濃度相差明顯）。
9. 按如下體系制備反應(yīng)混合液：

注：① 商用 DNA 提取試劑盒提取的 DNA，qPCR 模板以 2 μL 作為起始優(yōu)化體積；② 模板體積不得超過最終反應(yīng)體積的10%；③ 模板濃度：gDNA 做模板時，通常 1-10 ng 即可；④ PCR 引物的終濃度通常為 0.4 μM，可以得到較好的結(jié)果，反應(yīng)性能較差時，可以在 0.2 - 1 μM 范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。
10. 輕輕渦旋混勻反應(yīng)混合液，轉(zhuǎn)移固定體積至 PCR 管。
11. 測試程序（根據(jù)自備 qPCR Mix 試劑盒程序進行程序設(shè)定）。
12. 數(shù)據(jù)分析
使用活細菌和死細菌作為對照，分析計算樣本中活細胞數(shù)。建議開始 PMA qPCR 活細菌檢測前，先驗證引物及 PCR 程序是否合適。死、活細菌對照 dCt 計算
（1） qPCR 結(jié)束后，使用儀器軟件計算每個樣本的 Ct 值。
（2） 通過計算每個對照細菌的 dCt 的方式，判斷 PMA 是否成功抑制了死細菌 DNA 的擴增，計算如下：
dCt 活 = Ct(活, PMA 處理) - Ct(活, PMA 未處理)
dCt 死 = Ct(死, PMA 處理) - Ct(死, PMA 未處理)
（3） 活細菌的 dCt 期望值接近于 0 ± 1，這表明 PMA 不會影響活細胞 DNA 的擴增；
（4） 死細菌的 dCt 期望值大于 4（dCt 為 4 表示減少了約 16 倍，即去除了 94% 的死細菌 DNA；dCt 為 8 表示減少了約250 倍，即去除了 99.6%的死細菌 DNA）。
（5） 死細菌的 dCt 取決于許多因素，包括：菌株系/細胞類型；細菌被殺死方式；PMA 使用濃度；擴增序列長度。
13. 活細菌占比計算
如果死、活細菌對照結(jié)果正常，可以進入樣本中活細菌占比計算。
（1） 計算樣本的 dCt 值：
dCt 樣本 = Ct(樣本, PMA 處理) - Ct(樣本, PMA 未處理)
（2） 轉(zhuǎn)換 dCt 值為活細菌比例：
PMA 抑制倍數(shù) = 2（樣本 dCt）
活細菌% = 100 / PMA 抑制倍數(shù)
14. 計算活細菌的絕對數(shù)量
如果想計算樣本中活細菌的絕對數(shù)量☆，需要用已知數(shù)量的目標菌的基因組 DNA 制作標準曲線。建議稀釋的幾組基因組濃度在 qPCR 分析體系的范圍內(nèi)。
（1） 以 Ct 值為縱坐標，細胞數(shù)為橫坐標，制作標準曲線。
（2） 計算實驗樣本的拷貝數(shù)：
Ct = 斜率 * 細胞數(shù) + y 軸截距 （y = mx + b）
細菌數(shù)樣本 = （Ct – y 軸截距） / 斜率
注：純化過程中活細菌 DNA 未損失。

示例：

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