品牌：meilunstar

吖啶酯（NSP-SA-NHS）
分子式：C32H31N3O10S2  分子量：681.73
產(chǎn)品簡介：
吖啶酯（NSP-SA-NHS）及其相關(guān)化合物已被證明是非常有優(yōu)勢的化學發(fā)光標記物，其穩(wěn)定性、活性和敏感性超過了某些放射性同位素。吖啶酯能與含有一級氨基的蛋白發(fā)生反應。在堿性條件下，NHS 作為離去基團被取代，蛋白質(zhì)與吖啶酯形成穩(wěn)定的酰胺鍵。反應完成后，多余的吖啶鹽通過脫鹽柱除去。
在存在堿性過氧化氫時，吖啶標記的蛋白不需要酶催化可自行發(fā)光。具體發(fā)光原理是在堿性過氧化氫溶液中，吖啶酯受到過氧化氫離子的進攻，生成一個有張力的不穩(wěn)定的二氧乙烷，進一步分解成CO2和電子激發(fā)態(tài)的吖啶酮，當吖啶酮回到基態(tài)時發(fā)出最大吸收波長430nm的光子。這個發(fā)光過程是十分短暫（整個過程的發(fā)生小于2秒），觸發(fā)方案必須增加內(nèi)部光度計和光子探測器；另外，本產(chǎn)品也可以使用配備自動進樣器的多功能酶標儀進行發(fā)光數(shù)據(jù)采集。蛋白質(zhì)，多肽，抗體，核酸都可以用本產(chǎn)品進行標記。吖啶酯在堿性過氧化氫的激發(fā)下快速發(fā)光，因此通過收集光子可以檢測到標記化合物。
本產(chǎn)品主要用于：化學發(fā)光及免疫分析、受體分析、核酸及多肽檢測等研究。
物理性狀及指標：
外觀：……………………黃色粉末
含量：……………………≥95%

儲存條件：-20℃，充氮氣，避光防潮密閉干燥
儲液配置：按表中溶解性配置；如溶解困難，可以通過快速攪拌，超聲或溫和加熱（在45-60°C下水?。?。-80°C 儲存時，請在 6 個月內(nèi)使用，-20°C 儲存時，請在 1 個月內(nèi)使用。

	1 mg	5 mg	10 mg
1 mM	1.4669 mL	7.3343 mL	14.6686 mL
5 mM	0.2934 mL	1.4669 mL	2.9337 mL
10 mM	---	---	---

數(shù)據(jù)展示

 
圖1.  (A)競品對照的最大溶解度在DMSO為4mM，而美侖吖啶酯實測溶解度可以到15mM (10mg/ml)。圖A中兩管吖啶酯均為4mM DMSO 溶液，美侖與競品對照外觀上沒有明顯差別。(B)多功能酶標儀搭配自動進樣器（BioTek）檢測發(fā)光，設定接收信號濾波片460（±40）nm。2.5mg/ml DMSO溶液繼續(xù)使用DMSO稀釋500倍后（信號較強，防止燒壞儀器）至終濃度5ug/ml，取20ul 加到黑色96孔板并設置3個復孔，自動進樣器依次進發(fā)光液100uL，同時記錄信號值。結(jié)果顯示相同濃度的吖啶酯DMSO溶液，美侖組的發(fā)光略強于對照公司。（吖啶酯發(fā)光液配制：0.01M NaOH+ 0.05% 過氧化氫）

圖2. 使用較高濃度（10mg/ml）吖啶酯DMSO溶液20uL，直接加入100uL吖啶酯發(fā)光液，可以發(fā)射出肉眼可見的藍光（430nm）。但是該信號衰減很快，整個發(fā)光時間僅有幾秒鐘，因此需要使用具有閃光型化學發(fā)光采集功能的儀器進行信號采集。

 
圖3. 蛋白標記效果測試。以吖啶酯標記BSA為例，配制2.5mg/ml 吖啶酯 DMSO母液，溶有15mg/ml BSA 的0.2M碳酸氫鈉溶液(pH9.0)。為了充分標記BSA，避免染料殘留對效果驗證的影響，本次實驗使用的染料摩爾數(shù)低于常規(guī)用量，按照染料母液：蛋白溶液=1：100 體積比，總體積1ML。室溫標記1h后，過G25脫鹽柱，純化緩沖液為磷酸一氫鈉/磷酸二氫鈉 （1:1） 0.1M 混合體系，PH=6.7(鹽酸微調(diào))。結(jié)果顯示，相同的標記濃度體系，同一個G25純化柱純化，吖啶-BSA 發(fā)光體系也設定相同，吖啶-BSA流出液的顏色美侖比競品對照更深一些（圖A）。雖然標記前，兩家的吖啶酯光強相似，但是標記后，美侖的光強更有優(yōu)勢，比對照高一個數(shù)量級（圖B），說明蛋白標記對美侖組的吖啶發(fā)光基團的影響最小，并且美侖的吖啶酯在堿性標記蛋白質(zhì)過程中也更加穩(wěn)定，優(yōu)于競品對照！

使用說明（舉例抗體/蛋白質(zhì)標記）：

1.配制   

標記緩沖液：0.2M NaHCO3  (pH=9.0)；
標記終止緩沖液： 10% 賴氨酸  0.2M NaHCO3  (pH=9.0)溶液；
脫鹽純化緩沖液：0.1M Na2HPO4-NaH2PO4  (pH=6.5)；
吖啶酯發(fā)光液：(0.01~0.1M) NaOH+0.05% H2O2 。

2. 計算標記所用抗體（蛋白質(zhì)）和吖啶酯的量：
通常設定摩爾比n(抗體): n(吖啶酯)=1:10~1:50，具體需根據(jù)氨基酸組分進行摸索調(diào)整；
配制2.5mg/ml 吖啶酯-DMSO母液，注意玻璃器皿盛放并避光；
使用0.2M NaHCO3（pH=9.0） 溶液配制0.1~0.5 mg/ml 抗體反應液 。

3. 連接及純化
本說明書舉例針對標記抗體抗體的分子量為 180kd 對應 15 倍的吖啶酯。如果用戶的待標記樣品是其他的分子量，請參考附表 1 改變試劑的配比。
1．取 10 μL 稀釋吖啶酯母液 (2.5mg/ml)，加入 90 μL 無水 DMSO(or DMF) 稀釋10倍，配成吖啶酯工作液 (0.25mg/ml)。
2．使用0.2M NaHCO3  (pH=9.0)溶液稀釋 50μg 的抗體至 300 μL，加入 10 μL吖啶酯工作液 (0.25mg/ml)（參考附表 1）。
3．錫箔紙包好，室溫標記0.5~1h。
4．淬滅反應，加入 100 μL 標記終止緩沖液，室溫混勻 30 分鐘（注：如果標記較充分，也可以跳過此步驟，直接進行柱純化）。
5. 脫鹽柱純化，收集吖啶標記蛋白組分并檢測濃度，請參考說明書后文。
6．檢測標記的蛋白，取10μL吖啶標記蛋白，放于黑色96孔板中，向每個微孔注入 50 μL~150μL吖啶酯發(fā)光液，立即檢測，如果發(fā)光過強，可以對標記蛋白再進行若干倍的稀釋，使其在儀器的發(fā)光檢測限內(nèi)。注：吖啶酯發(fā)光液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，或者將NaOH溶液和過氧化氫溶液分別配成2x母液，使用的時候再1：1進行混合。
7．吖啶酯標記的蛋白可以在酸性緩沖液中4℃避光存儲（注意補加疊氮鈉等防腐劑），如果儲存效果不佳，則請避光保存于-20℃或者-80℃。

注意事項：

1.吖啶酯除了DMF，也可以用無水DMSO等非質(zhì)子性溶劑來溶解。通常吖啶酯用DMF最高溶解的濃度為4mM (約2.7mg/ml)，我司生產(chǎn)的吖啶酯中DMSO中溶解度可達10mg/ml。
2.標記前，由于吖啶酯末端羧基經(jīng)NHS活化,較為活潑，請用非質(zhì)子性的干燥無水溶劑來溶解；標記后，標記后吖啶酯與被標記物之間以酰胺鍵或者酯鍵等形式存在，酸性溶劑基本沒有影響；吖啶酯本身活性位點在堿性和氧化環(huán)境下不穩(wěn)定，因此應根據(jù)被標記物的穩(wěn)定性配制相應的非強堿性非氧化的體系中處理和保存。
3.發(fā)光標記物在光照條件下有可能部分分解，以致影響發(fā)光效果。吖啶酯的實驗操作和儲存建議避光條件下處理，目前暫時沒有具體的研究數(shù)據(jù)。
4.吖啶酯標記蛋白等大分子化合物建議用G25脫鹽柱分離；吖啶酯標記小分子化合物建議用柱層析分離;
5.吖啶酯發(fā)光過程是十分短暫（整個過程的發(fā)生小于2秒），觸發(fā)方案必須增加內(nèi)部光度計和光子探測器；另外，本產(chǎn)品也可以使用配備自動進樣器的多功能酶標儀進行發(fā)光數(shù)據(jù)采集，最大限度降低加樣時間對采集信號的影響。
6.吖啶酯標記化學發(fā)光檢測儀器推薦：
美國PE公司的 Wallac 1420 多功能檢測儀,
德國西門子拜耳化學發(fā)光儀ADVIA Centaur

附表 1： 吖啶用量對照表

吖啶酯標記蛋白效率計算方法
1. 取100uL 待測樣品，稀釋至Abs280在0.1~1.5之間；
2. 向1中加入少量鹽酸，調(diào)整至pH=1~2，使其形成具有黃色特征的鹽溶液，吸收峰在367nm
3. 分別測試待測樣品的Abs280nm 和Abs367nm ；
4. Equation1: 吖啶酯濃度(mol/L)=Abs367/14650 ；
5. 校正蛋白Abs280數(shù)值
Equation2: Abs280(校正后) = Abs280- (Abs367×0.17);
6. 準備1mg/ml 未標記的蛋白溶液（e.g. 50ug 蛋白加入50μL 標記緩沖液），取出10μL 并補加490μL ddH2O (稀釋50倍)。讀取Abs280nm ，并乘以稀釋倍數(shù)。
7. 計算蛋白質(zhì)量濃度（mg/ml）
     Equation3:蛋白摩爾濃度 （mol/L）
8. 計算F/P摩爾比