一、 試劑盒簡介
本試劑盒是簡單快速從細胞到cDNA的一步法試劑盒，無需復雜的microRNA提取步驟，試劑盒中含有gDNA Remover可有效去除基因組DNA，極大降低了基因組DNA的污染。具體過程是：根據(jù)細胞數(shù)，按照80 μl /10萬細胞的量加Cell Lysis Buffer，吹吸10次，充分裂解細胞；吸出4 - 8 μl細胞裂解產(chǎn)物，加入0.8 μl gDNA Remover，室溫反應(yīng)5 min，即可去除基因組DNA。然后配制逆轉(zhuǎn)錄體系，充分混勻后，只需37℃反應(yīng)15 min 、42℃反應(yīng)10 min即可得到對應(yīng)細胞內(nèi)所有microRNA的cDNA。
二、產(chǎn)品組分
Component | EZB-miRT1 (50 Rxns) |
Cell Lysis Buffer | 11 ml |
gDNA Remover | 50 μl |
miRNA RT Enzyme Mix | 110 μl |
4× miRNA RT Buffer | 275 μl |
Universal 3’ qPCR Primer (10 μM) | 750 μl |
U6 Primer (10 μM ) | 150 μl |
Nuclease free ddH2O | 1 ml |
三、保存條件
此試劑盒建議置于-20℃冰箱中保存。
四、試劑盒特點
1、簡單、快速： 僅需4步大約28 min即可得到對應(yīng)細胞內(nèi)所有microRNA的cDNA。
2、基因組殘留少：配有gDNA Remover，可有效去除DNA污染。
3、所需樣品少：最低可提取1000個細胞。
3、 安全無毒：不使用苯酚、氯仿、異丙醇、DEPC水等對身體有害的物質(zhì)。
五、注意事項
1、本試劑盒是專為qPCR設(shè)計的，盡量不要用于基因克隆。
2、建議用24、48或96孔板培養(yǎng)細胞。細胞密度達到80%為。
3、細胞從培養(yǎng)箱中取出后建議放在室溫，切勿放在冰上，以免影響細胞狀態(tài)。
4、初次使用時建議對細胞進行計數(shù)，之后可參考細胞估數(shù)圖進行估數(shù)。
5、Cell Lysis Buffer解凍后，需顛倒幾次使之充分混勻，再放在冰上以備使用，請勿渦旋振蕩。
6、本試劑盒是根據(jù)細胞來加裂解液，裂解液最少應(yīng)該能夠充分覆蓋培養(yǎng)孔底部，否則過少容易導致吹出泡沫，或者裂解不充分。
7、gDNA Remover 和4× RT Mix在使用前都要上下顛倒混勻，短暫離心至管底。由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取時應(yīng)慢慢吸取。同時，要使用精確、量程適合的移液槍，并且不要使Tip插入液面過深，否則會因Tip壁粘著造成損失，而使酶量不足。
8、當同時需要進行數(shù)次反應(yīng)時，應(yīng)先配制各種試劑的混合液，然后再分裝到每個反應(yīng)管中。這樣可使所取的試劑體積更準確，減少試劑損失，避免重復分取同一試劑。同時也可以減少實驗操作或?qū)嶒炛g產(chǎn)生的誤差。
關(guān)鍵字： microRNA提取，試劑盒，細胞;