纖維素（CLL）含量試劑盒說明書
分光光度法50管/48樣
注 意 ：正式測(cè)定前取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖，通常與半纖維素、果膠和木質(zhì)素結(jié)合在一起，是植物細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分。纖維素是一種重要的膳食纖維，是自然界中分布最廣、含量最多的一種多糖。
纖維素（CLL）含量試劑盒測(cè)定原理：
纖維素為β－葡萄糖殘基組成的多糖，在酸性條件下加熱能分解成β－葡萄糖。β－葡萄糖在強(qiáng)酸作用下，可脫水生成β－糠醛類化合物。β－糠醛類化合物與蒽酮脫水縮合，生成糠醛衍生物。顏色的深淺可間接定量測(cè)定纖維素含量。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、80％乙醇、丙酮、濃硫酸（不允許快遞）、研缽和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一：液體50mL× 1瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1瓶，4℃避光保存。
試劑三：液體10mL× 1支，4℃保存。
樣品的前處理：
1、 細(xì)胞壁的提?。?/span>取約0.3g樣本，加入1mL 80％乙醇，室溫快速勻漿，90℃水浴20min（加熱過程中EP管可能爆開，建議用膠帶封口或使用防爆EP管），冷卻至室溫，6000g 25℃離心10min，棄上清。沉淀加入1.5mL80％乙醇和丙酮各洗一遍（渦旋振蕩2min左右，6000g 25℃離心10min，棄上清即可），沉淀即為粗細(xì)胞壁，加入1mL試劑一（去除淀粉）浸泡15小時(shí)，6000g 25℃離心10min，棄上清，將沉淀干燥，稱重得細(xì)胞壁物質(zhì)（CWM）。
2、 纖維素的提取：稱取烘干的CWM約 5mg，加入0.5mL蒸餾水充分勻漿(若烘干物質(zhì)質(zhì)地堅(jiān)硬，可先研碎后再加入0.5mL蒸餾水勻漿，或者用勻漿器勻漿)，勻漿液轉(zhuǎn)移至EP管中，用蒸餾水定容至0.5mL，置于冰水浴中，緩慢加入0.75mL濃硫酸，混勻，冰水浴中靜置30min。8000g 4℃離心10min，取上清液，用蒸餾水稀釋20倍后待測(cè)。
纖維素（CLL）含量試劑盒測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至620nm，蒸餾水調(diào)零。
2、調(diào)節(jié)水浴鍋至95度。
3、工作液的配制：在試劑二中加入4mL試劑三，充分溶解，如較難溶解，可加熱攪拌；用不完的試劑4℃保存一周；
4、加樣表（在EP管中反應(yīng)）：
試劑（μL） | 空白管 | 測(cè)定管 |
樣本 |
| 300 |
蒸餾水 | 300 |
|
工作液 | 70 | 70 |
濃硫酸 | 630 | 630 |
混勻，置95度水浴中10min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻至室溫后，于620nm處，分別讀取空白管和測(cè)定管吸光值，ΔA=A測(cè)定管-A空白管。
注意：
1、空白管只要做一管。
2、由于濃硫酸具有強(qiáng)腐蝕性，請(qǐng)謹(jǐn)慎操作。
纖維素含量計(jì)算：
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 7.875x - 0.0043；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為吸光值。
2、按樣本質(zhì)量計(jì)算：
纖維素（mg /g干重）= [(ΔA＋0.0043) ÷7.875×V1]÷（W×V1÷V2）×20=3.17×(ΔA＋0.0043) ÷W。
V1：加入樣本體積，0.3mL；V2：加入提取液體積，1.25mL；W：樣本干重，約5×10-3g；20：樣本稀釋倍數(shù)。
注意：最低檢測(cè)限為1mg/g干重或10ng/ mg prot
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