乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）含量測定試劑盒說明書

分光光度法10管/9樣

注    意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）含量測定試劑盒測定意義：

乙酰輔酶A廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中。是生物體能源物質代謝過程中產生的一種重要的中間代謝產物。在體內能源物質代謝中是一個樞紐性的物質。糖、脂肪、蛋白質三大營養(yǎng)物質通過乙酰輔酶A匯聚成一條共同的代謝通路-三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化，經(jīng)過這條通路徹底氧化生成二氧化碳和水，釋放能量用于ATP合成。此外，乙酰輔酶A是合成脂肪酸，酮體，膽固醇及其衍生物等生理活性物質的前體物質。

測定原理：

蘋果酸脫氫酶可催化蘋果酸和NAD生成草酰乙酸和NADH。檸檬酸合酶可催化乙酰輔酶A和草酰乙酸生成檸檬酸和輔酶A。利用蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶的偶聯(lián)反應，乙酰輔酶A含量和NADH的生成速率成正比，340nm下吸光值的上升速率反應了乙酰輔酶A含量的高低。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體10mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1支，-20℃保存。臨用前加入100μL試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑三：液體4μL×1支，4℃保存。臨用前加入100μL試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑四：粉劑×1瓶，-20℃保存。臨用前加入9mL試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑五：液體10mL×1瓶，4℃保存。

工作液的配制：臨用前請根據(jù)擬用工作液體積（樣本數(shù)×0.92 m L），將試劑二、三和四按照1:1:90的比例混合，或者直接把試劑二和試劑三加入到試劑四中混勻（可以測定9樣）；加樣前置37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴鍋中預熱30 min；現(xiàn)配現(xiàn)用；

乙酰輔酶A的提取：

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）含量測定試劑盒測定步驟：

1、 分光光度計預熱30min，用蒸餾水于340nm處調零。

2、取920μL工作液和100μL樣本至 1mL石英比色皿，混勻，立即記錄340nm處20s的吸光值A1和80s時的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

乙酰輔酶A含量計算：

標準條件下測定的回歸方程為y = 1640x + 0.012；x為吸光值，y為標準品濃度（nmol/mL）。

注意：本試劑盒最低檢測限為1.6nmol/mL。

（1）按照蛋白濃度計算

乙酰輔酶A含量(nmol/mg prot)=[(1640×ΔA＋0.012) ×V1]÷(V1×Cpr)=(1640×ΔA＋0.012) ÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒。

（2）按照樣本質量計算

乙酰輔酶A含量(nmol/g 鮮重)=[(1640×ΔA＋0.012) ×V1]÷(W×V1÷V2)=(1640×ΔA＋0.012) ÷W

 (3 ) 按照細菌或細胞密度計算：

乙酰輔酶A含量(nmol/10⁴)=[(1640×ΔA＋0.012)×V1]÷(500×V1÷V2)=(1640×ΔA＋0.012)÷500

V1：加入反應體系中樣本體積，0.1mL；V2：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。