莽草酸脫氫酶（Shikimate dehydrogenase，SD）試劑盒說明書

                                  分光光度法 50管/48樣

注   意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：                           

莽草酸途徑是存在于植物、真菌和微生物中的一條重要的代謝途徑，莽草酸脫氫酶是莽草酸合成途徑中的關(guān)鍵酶。

高鐵還原酶（ferric-chelate reductase,FCR）試劑盒測定原理：

莽草酸脫氫酶催化莽草酸和NADP產(chǎn)生NADPH，檢測340nm下的吸光值增加速率來表示SD活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×2瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

高鐵還原酶（ferric-chelate reductase,FCR）試劑盒測定步驟：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 樣本測定

（1）在試劑二中加入25mL試劑一充分溶解混勻，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min，現(xiàn)配現(xiàn)用。

（2）取0.05mL樣本和0.95mL試劑二于1mL比色皿中，混勻，在340 nm波長下立即記錄20秒時的初始吸光度A1和5分20秒時的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

SD活性計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

SD（nmol /min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V×樣Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘每分鐘產(chǎn)生1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

SD（nmol /min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘每分鐘產(chǎn)生1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

SD（nmol /min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.286×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。