6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6 - phosphogluconate dehydrogenase， 6-PGDH）說明書

                                            分光光度法  50管/48樣

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6 - phosphogluconate dehydrogenase， 6-PGDH）測定意義：

磷酸戊糖途徑途徑中6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）和6PGDH依次催化NADPH合成，與能量的平衡、生長速率和細胞活力等密切相關(guān)。此外，6PGDH逆境生理中具有重要作用。

測定原理：

6PGDH催化6-磷酸葡萄糖酸和NADP⁺生成NADPH，NADPH在340 nm有特征吸收峰，而NADP⁺沒有；通過測定340nm吸光度增加速率，計算6PGDH活性。

自備儀器和用品：

紫外分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、1mL石英比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體47.5mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存。

6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6 - phosphogluconate dehydrogenase， 6-PGDH）粗酶液提?。?/span>

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為1000~5000：1的比例（建議2000萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定操作：

1. 分光光度計預熱30min，調(diào)節(jié)波長到340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移至試劑一中充分溶解；在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min以上；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

3. 取1mL石英比色皿，依次加入50μL樣本和950μL試劑一，于340nm處測定3min內(nèi)吸光值變化，第10 s吸光值記為A1，第190s吸光值記為A2。△A=A2-A1

注意：空白管只需要做一次。

計算公式：

1、血清（漿）6PGDH活力的計算:

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。

6PGDH（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=1071.8×ΔA

2、組織、細菌或細胞中6PGDH活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

6PGDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1071.8×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

6PGDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=1071.8×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

6PGDH（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(2000×V樣÷V樣總) ÷T=0.536×ΔA

V反總：反應體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，3 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細菌或細胞總數(shù)，2000萬。