胃蛋白酶（Pepsin）試劑盒說明書

                                                  分光光度法  50管/24樣

注    意： 正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

胃蛋白酶（Pepsin）試劑盒測定意義：                           

胃蛋白酶由胃粘膜主細胞分泌，分解食物中蛋白質(zhì)成小肽段。一般用于神經(jīng)性低酸癥的鑒別，慢性胃炎、慢性胃擴張、慢性十二指腸炎等癥狀時也會引起胃蛋白酶分泌的減少。

測定原理：

胃蛋白酶可催化血紅蛋白水解，水解產(chǎn)物與福林試劑反應(yīng)后顯藍色；一定范圍內(nèi)，其顏色的深淺與胃蛋白酶活性呈正比。

自備儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體50mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體50mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加入25 mL試劑二充分溶解。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入25 mL蒸餾水充分溶解。

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入30 mL蒸餾水充分溶解。

試劑六：液體5mL×1瓶，4℃保存。

標準品：液體1.26mL×1支，0.5 μ mol/mL酪氨酸標準溶液濃度4℃保存。

胃蛋白酶（Pepsin）試劑盒粗酶液提取：

組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，即粗酶液。

測定步驟：

1.分光光度計預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到580 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三和試劑四置于37℃水浴預(yù)熱30min。

3. 標準管：取玻璃比色皿，加入100μL標準品，200μL試劑二，600μL試劑五，100μL試劑六，混勻后室溫靜置20min，于580 nm測光吸收，記為A標準管。

4. 空白管：取玻璃比色皿，加入100μL蒸餾水，200μL試劑二，600μL試劑五，100μL試劑六，混勻后室溫靜置20min，于580 nm測光吸收，記為A空白管。

5. 對照管：取EP管，加入500 μL蒸餾水，置于37℃水浴保溫10min；加入500μL試劑四，蓋緊后搖勻1min；加入100μL粗酶液，混勻后8000g 4℃離心10分鐘取上清；在玻璃比色皿中加入上清液100μL，再加入200μL試劑二，600μL試劑五，100μL試劑六，混勻后室溫靜置20min，于580 nm測光吸收，記為A對照管。

6. 測定管：取EP管，加入100μL粗酶液，500 μL試劑三，置于37℃水浴保溫10min；加入500μL試劑四，

蓋緊后搖勻1min；8000g 4℃離心10分鐘取上清；在玻璃比色皿中加入上清液100μL，再加入200μL試劑二，600μL試劑五，100μL試劑六，混勻后室溫靜置20min，于580 nm測光吸收，記為A測定管。

注意：空白管和標準管只需要測定一次。

胃蛋白酶（Pepsin）試劑盒計算公式：

(1) 按照蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃每毫克蛋白每分鐘催化血紅蛋白水解生成1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

胃蛋白酶活性（nmol/min/mg prot）=C標準品×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V1）÷T=5500×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）÷Cpr

C標準品：標準品濃度，0.5 μ mol/mL酪氨酸；稀釋倍數(shù)：（100+500+500）÷100=11；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（mL），100μL=0.1 mL；T：催化反應(yīng)時間（min），10min。

（2）按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：37℃每克組織每分鐘催化血紅蛋白水解生成1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

胃蛋白酶活性（nmol/min/g鮮重）=C標準品×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）×稀釋倍數(shù)÷（W×V1÷V2）÷T=5500×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）÷W

C標準品：標準品濃度，0.5 μ mol/mL酪氨酸；稀釋倍數(shù)：（100+500+500）÷100=11；W：組織質(zhì)量（g）；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（mL），100μL= 0.1 mL；V2：粗酶液總體積（mL），1mL；T：催化反應(yīng)時間（min），10min。

注意事項

試劑三、試劑四、試劑五臨用前配制，配制好用不完的試劑4℃可保存一周。