【唇飾帶線蟲染料法熒光定量PCR試劑盒利用PCR原理，定性檢測病毒，對病毒引起的疾病診斷及療效評估有重要指導意義。

【檢驗原理】

利用離心柱內硅基質膜提取RNA，在反轉錄酶的作用下，以RNA為模板，以引物為起點合成與RNA模板互補的cDNA鏈。在TaqDNA聚合酶的作用下，經高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環(huán)，使特異DNA片段的拷貝數(shù)放大一倍。經過35次循環(huán)，最終使擴增DNA片段放大了數(shù)百萬倍。將擴增DNA片段進行電泳，經染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見到DNA片段的擴增帶。

【主要組成成份】

注：陰性對照為基因組DNA，陽性對照為失去活性的貓冠狀病毒cDNA。

【儲存條件及有效期】-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個月。

【需自備的物品】PCR擴增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀、可調移液器、瓊脂糖等相關試劑及設備。

【注意事項】

1.病毒具有很強的感染能力，操作前必須準備好各種防御措施。

2.操作時須嚴格按照步驟進行，廢物必須放入含消毒液的廢物缸，以免污染實驗室和工作人員。

3.為避免其他核酸的污染而出現(xiàn)假陽性，必須使用不含DNA和RNA的離心管、吸管、槍頭、試劑和手套，操作人員須戴口罩。

【實驗準備】

如果是提取病毒RNA，請選用RNase free Tip槍頭和1.5 ml離心管或將槍頭和離心管用0.1% DEPC水處理后再使用。

【唇飾帶線蟲染料法熒光定量PCR試劑盒操作步驟】

1.樣品處理

(1). 適用標本類型：發(fā)病動物血液、空腸及小腸腸內容物及組織臟器(腸道組織、腸系膜及淋巴結等)和病毒培養(yǎng)液。

(2). 標本采集，方法如下：

a.血清：用一次性注射器取靜脈血2-3ml，轉至5ml 的干燥管中，密閉送檢。

b.腸內容物：無菌條件下取腸道內容物約1g 左右，置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理鹽水)的5ml 離心管中，立即送檢。

c.組織臟器：取發(fā)病動物腸道組織及腸系膜淋巴結等組織約1g，置一1.5ml的潔凈離心管中，密閉送檢。

(3).應避免標本間交叉污染。

(4).標本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應凍存于-80℃以下，避免反復凍融。

2. 提取過程

用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3. RT-PCR擴增

（1）每份總體積20 μL，含15 μL RT-PCR反應液（用前混勻），3μL 混合酶液，2 μL模板RNA。

例如：n份樣品，配制n+1份，15×（n+1）RT-PCR反應液， 3×（n+1）混合酶液勻后取18 μL分裝成n份，分別加入2 μL模板RNA，作好標記。

（2）在PCR擴增儀上進行以下程序：50 ℃ 10 min，94 ℃ 3 min；循環(huán)94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35次；再72 ℃延伸7 min。

4. 電泳

稱1.5 g瓊脂糖放于500 mL錐形瓶中，加入1倍TAE電泳緩沖液100 mL（取2 mL 50倍TAE電泳緩沖液，用雙蒸水稀釋至100 mL），于微波爐中熔解，待冷卻至50℃左右再加入50 μL染色液（自備）混勻。在電泳槽內放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將PCR擴增產物中加入4μL上樣緩沖液（自備）混勻后取10 μL點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以110～120V電壓于1倍TAE電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察結果。（注：染色液是2000×，上樣緩沖液是6×）

【結果判定】

陽性對照出現(xiàn)191 bp擴增帶、陰性對照無帶出現(xiàn)（引物帶除外）時，實驗結果成立。被檢樣品出現(xiàn)191 bp擴增帶為貓冠狀病毒陽性，否則為陰性。

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