人肝成纖維原代細(xì)胞培養(yǎng)操作
取新生1天的SD大鼠,在無菌條件下用眼科剪剪除背部皮膚,剪去全部脊椎,將脊椎腹側(cè)朝下置于滅菌毛玻璃片上。在解剖顯微鏡下,沿椎管兩側(cè)水平剪除背側(cè)一半椎骨,暴露脊髓和神經(jīng)節(jié)。用微解剖鑷剝離脊髓后,從椎間孔中挑出背根神經(jīng)節(jié),置于盛有預(yù)冷PBS液的滅菌玻璃平皿中,剝除神經(jīng)節(jié)被膜后,用1ml移液器將神經(jīng)節(jié)移入15ml離心管中,PBS離心漂洗2次。離心管中加入4ml 0.125%胰蛋白酶,吹打、混懸神經(jīng)節(jié),置于37℃培養(yǎng)箱中孵育20min,加入4ml DMEM完全培養(yǎng)基終止消化,離心漂洗2次后,再加入2ml Neurobasal培養(yǎng)基(含4.5g/L D-葡萄糖,2mmol/L L-谷氨酰胺、1%FBS、20ml/L B-27添加劑、10ug/ml NGF、青霉素100U/ml、鏈霉素100ug/ml)。移液器反復(fù)吹打20-30次,使背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞盡可能分散,經(jīng)200目不銹鋼網(wǎng)過濾,制成細(xì)胞懸液,接種于預(yù)先涂有PLL的細(xì)胞培養(yǎng)板中,接種密度為2-3x105/ml細(xì)胞,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)中靜置培養(yǎng),每周換液2次。
人肝成纖維原代細(xì)胞處理及主要試劑
SD大鼠(新生1d),購自武漢大學(xué)中南醫(yī)院動物實驗中心;
NGF購自PeproTech公司;
Neurobasal培養(yǎng)基、DMEM、胎牛血清(FBS)、B-27添加劑(50X)購自Gibeo公司;
L-谷氨酰胺、多聚賴氨酸(PLL)胰蛋白酶購自Sigma公司;
胰蛋白酶購自AMRESCO公司;
雙抗(青、鏈霉素)購自HyClone公司
人肝成纖維原代細(xì)胞傳代培養(yǎng)操作
1、 細(xì)胞貼壁生長,鋪滿瓶底80%左右或有細(xì)胞堆疊生長時即可傳代;
2、棄去原瓶培養(yǎng)液,用PBS清洗1~2次,加入3~4ml新鮮培養(yǎng)液,用細(xì)胞刮沿一個方向依次將瓶底細(xì)胞刮下,不要反復(fù)來回刮,對細(xì)胞損傷較大。刮完后可在鏡下觀察,若細(xì)胞團(tuán)較多可用吸管輕輕吹散。也可直接用吸管吹打收集細(xì)胞,一般會有部分細(xì)胞吹不下來,可收集吹下來的部分細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),切忌吹打過度。
3、將收集到的細(xì)胞按一定比例分裝到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),一般3~4h內(nèi)大部分細(xì)胞都會貼壁,若細(xì)胞碎片較多可在細(xì)胞貼壁后換液除去。
1. 確保所有實驗室材料都無菌
交叉污染是細(xì)胞培養(yǎng)的大敵。即使是最輕微的污染,也可能毀了幾個星期的成果。因培養(yǎng)箱內(nèi)溫暖潮濕,真菌極易生長,因此必須注意定期清潔。此外,在將 培養(yǎng)瓶、移液管及其他的相關(guān)物品放入超凈臺之前,應(yīng)用酒精擦拭干凈,以避免污染。
2. 小心處理您的培養(yǎng)物
細(xì)胞培養(yǎng)的脆弱性怎么強(qiáng)調(diào)也不為過。 劇烈搖晃,或連續(xù)的溫度波動可能會對生長產(chǎn)生不利的影響。確保培養(yǎng)箱是水平的,溫度均一,且遠(yuǎn)離電動儀器。此外, 盡量避免一次處理多個細(xì)胞系,因為它可能會影響細(xì)胞的基因型和表型。您還應(yīng)定期完成STR圖譜分析,以確認(rèn)細(xì)胞系的身份。
3. 在使用前正確解凍細(xì)胞
盡管解凍看起來是個簡單的步驟,但必須操作得當(dāng),以免傷害細(xì)胞。長時間暴露在高溫條件下會使細(xì)胞無法鋪板。因此,凍存管應(yīng)當(dāng)在37°C水浴中放置2分鐘,然后用條件培養(yǎng)基稀釋,以避免DMSO造成直接傷害。
4. 使用對數(shù)生長期的細(xì)胞
細(xì)胞培養(yǎng)過程共有3個階段:停滯期、 對數(shù)期和平臺期,分別代表了低細(xì)胞生長、高細(xì)胞生長和無細(xì)胞生長。最有活力的細(xì)胞是健康的,快速分裂的,在對數(shù)期以70-80%的匯合度存在。
5. 在傳代之前不要讓細(xì)胞完全匯合
匯合度是指貼壁細(xì)胞占據(jù)培養(yǎng)瓶表面積的比例。完全匯合意味著100%的表面都被貼壁細(xì)胞覆蓋。一定要避免這種狀態(tài),因為它意味著細(xì)胞不能繼續(xù)生長。不過,當(dāng)務(wù)之急是使用活躍生長的細(xì)胞。
6. 選擇的培養(yǎng)基開發(fā)策略
在細(xì)胞培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)基是控制產(chǎn)品質(zhì)量、產(chǎn)量和成本的最重要因素。必須針對每種培養(yǎng)物來定制培養(yǎng)基,以優(yōu)化實驗結(jié)果。在決定以哪種方式來開發(fā)您的培養(yǎng)基時,您有幾個選擇。您可以購買現(xiàn)成的,自己開發(fā),也可以與另一家公司合作開發(fā)特定的培養(yǎng)基。在這個過程中,您需要考慮時間和成本等因素。
7. 配制干粉培養(yǎng)基時評估水的質(zhì)量
液體培養(yǎng)基往往會帶來比干粉培養(yǎng)基更高質(zhì)量的結(jié)果。這可能與水的質(zhì)量有關(guān)。由于細(xì)菌在水中迅速生長,故需要監(jiān)控內(nèi)毒素及其他污染物。專業(yè)公司有資源來控制細(xì)菌生長,比如過濾器。因此使用專業(yè)化生產(chǎn)的液體培養(yǎng)基會更加可靠一點。
8. 利用細(xì)胞的代謝特性來優(yōu)化培養(yǎng)基
分析使用過的培養(yǎng)基,有助于鑒定必要成分的代謝速率,包括氨基酸和維生素。從細(xì)胞生長階段和蛋白生產(chǎn)階段收集到的動態(tài)代謝圖譜可用來平衡基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加培養(yǎng)基,指導(dǎo)培養(yǎng)基的重點。
9. 避免細(xì)胞的過度消化
胰蛋白酶通過消化負(fù)責(zé)讓細(xì)胞與容器結(jié)合的蛋白質(zhì),而實現(xiàn)貼壁細(xì)胞的傳代。如果細(xì)胞暴露在胰酶中時間太長,則胰酶將開始切割細(xì)胞表面蛋白,這會影響細(xì)胞行駛正常功能的能力。
10. 培養(yǎng)基中不要一直使用抗生素
隨著細(xì)胞培養(yǎng)物更加頻繁地暴露在抗生素中,對抗生素有著天然耐藥性的菌株將開始出現(xiàn)。這種現(xiàn)象可掩蓋潛在的污染,這對實驗是非常有害的。
人肝成纖維原代細(xì)胞注意事項
1、 培養(yǎng)過程中要盡量減少熱源的接觸,建議用一次性使用的瓶皿培養(yǎng),一切與細(xì)胞接觸的器具要進(jìn)行去熱源處理,建議使用進(jìn)口血清;
2、傳代時吹打不宜過度,吹下來的細(xì)胞足夠傳代即可,不要反復(fù)吹打;
3、細(xì)胞生長速度很快,一般1~2天要傳一次代,密度達(dá)到80%左右即可傳代,可以適當(dāng)降低接種密度,但密度較低時細(xì)胞會成堆生長,當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞堆疊生長時也應(yīng)當(dāng)傳代;
4、若沒時間處理細(xì)胞,為避免細(xì)胞長過,可適當(dāng)降低血清濃度(不低于5%)以減緩細(xì)胞生長速度,但不宜長期低血清培養(yǎng),一般需正常培養(yǎng)1~2代以恢復(fù)其狀態(tài)。
關(guān)鍵字: 人肝成纖維原代細(xì)胞;原代細(xì)胞;細(xì)胞系;
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