慢病毒包裝試劑盒

一、產(chǎn)品簡介。

本產(chǎn)品包括慢病毒包裝質(zhì)粒（Lenti-Mix）、陽性對照質(zhì)粒（lenti-GFP）、質(zhì)粒 DNA 轉染試劑（Omifection）和病毒感染增強試劑（polybrene），其中包裝質(zhì)粒能夠與已經(jīng)構建的慢病毒骨架質(zhì)粒聯(lián)合，生產(chǎn)高滴度的慢病毒。

二、運輸和存儲條件。

1. 本產(chǎn)品低溫運輸，各組份依據(jù)保存條件分開保存，自購買之日起，有效期為 12 個月。

2. Omifection 與 Polybrene 嚴禁凍存。

三、特點與優(yōu)勢。

1. 本試劑盒中的包裝質(zhì)粒能夠與多家公司提供的慢病毒骨架質(zhì)粒配合，生產(chǎn)高滴度的慢病毒。

2. 本試劑盒中的轉染試劑 Oimifection，轉染效率高，可以保證生產(chǎn)高滴度的慢病毒。

四、自備試劑與耗材。

1. OPTI-MEM 培養(yǎng)液 (Gibco)

2. 293T 細胞，是 293TN 細胞（System Biosciences），病毒生產(chǎn)量大。

五、 使用說明

1. 慢病毒包裝。

1) 細胞培養(yǎng)。293T 細胞傳代接種于細胞培養(yǎng)皿（Φ 100 mm），置于 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后細胞密度達到 60%～80%。（細胞密度不宜過大，否則影響轉染效率）

2) 轉染。向 Lenti-Mix 中加入 1 mL OPTI-MEM 培養(yǎng)液，再加入 9 μg 慢病毒骨架質(zhì)粒（目的蛋白過表達或 RNAi 質(zhì)粒，或一管 GFP 對照質(zhì)粒），混勻，加入 54 μL 轉染試劑 Omifection，混合 10 次，室溫靜置 30 min，滴加入細胞培養(yǎng)液中，輕輕搖勻。

3) 換液。轉染 6-12 h，更換成新鮮的細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

4) 慢病毒收集。轉染 48 h，收集批含有慢病毒的細胞培養(yǎng)上清（暫時置于 4 ℃冰箱中保存），5) 293T 細胞中再加入 10 ml 新鮮的細胞培養(yǎng)液，24-48 h 后，收集第二批含有慢病毒的細胞培養(yǎng)上清（第二批細胞培養(yǎng)上清中的慢病毒滴度高于批）。

6) 離心。含有慢病毒的細胞培養(yǎng)上清轉入離心機，3 000 rpm，4 ℃離心 5 min，棄沉淀，上清轉入新的無菌離心管，即為含有慢病毒的細胞培養(yǎng)上清。

7) 含有慢病毒的細胞培養(yǎng)上清可在 4 ℃保存 1 個月，長期保存應置于-80 ℃，但凍融一次，病毒感染效果降低 30-50%。

2. 慢病毒感染

1) 目的細胞培養(yǎng)。目的細胞傳代后接種到細胞培養(yǎng)皿（Φ 100 mm）中，24 h 后細胞密度達到30%-50%。

2) 慢病毒感染。棄培養(yǎng)液，加入 5 ml 新鮮培養(yǎng)液和 5 mL 含有慢病毒的細胞培養(yǎng)上清液，再加入病毒感染增強試劑（polybrene，1: 500-1:2000 稀釋），輕搖，混勻。

3) 換液。病毒感染 12-24 h 后更換成新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，若無細胞毒性，可以不換液。

4) 檢測。慢病毒感染 72 h，熒光顯微鏡下觀察 GFP 表達情況，或檢測目的基因表達水平。

六、注意事項。

1. 請使用高純度的慢病毒骨架質(zhì)粒用于轉染，質(zhì)粒的 OD260/OD280 比值在 1.8～2.0 之間為宜。

2. 293T 細胞生長狀態(tài)對于病毒包裝至關重要，因此需要保證良好的細胞生長狀態(tài)，一般使用代數(shù)較低（20 代以內(nèi)）的 293T（N）細胞進行慢病毒包裝。

3. 293T 細胞的密度應該控制在 60-80%之間，密度過低，病毒產(chǎn)量較低，密度過高，則轉染效率降低，也會導致慢病毒滴度的降低。

4. 本試劑盒提供的轉染試劑（Omifection）與病毒感染增強試劑（polybrene）嚴禁凍存。

5. 為了增強慢病毒感染效果，可以使用本公司的慢病毒感染增強試劑盒（Cat：OmL-04），其感染增強效果比對 Polybrene 可以提高 4-8 倍。