5(6)-FITC (Fluorescein 5(6)-isothiocyanate) is an amine-reactive derivative of a fluorescent dye, characterized by high absorbance and excellent fluorescence quantum yield. The isothiocyanate group of FITC can react with various functional groups on proteins, including amines, thiols, imidazoles, tyrosines and carbonyls, enabling the labeling of proteins such as antibodies and lectins. 5(6)-FITC has a wide range of applications, including flow cytometry, immunofluorescence, protease assays and conjugation. The maximum excitation/emission wavelengths are 492/518 nm^[1][2][3][4].

儲(chǔ)存液制備^[1]
在丙酮或 DMSO 中制備 1 mg/mL 5(6)-FITC 儲(chǔ)備溶液，并儲(chǔ)存于 0℃。
工作液制備：在磷酸鹽緩沖液 (PBS) 中制備 2.5 pg/mL，PH 調(diào)至 7.8。
5(6)-FITC 用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)^[1]
(1) 細(xì)胞準(zhǔn)備：用 10 mL PBS 將細(xì)胞從固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂板上洗凈，在 2000 g 下離心 30 min，然后用 10 mL 70% 乙醇重懸，4℃ 孵育。
(2) 染色：取 3×10⁵ 細(xì)胞并離心，將細(xì)胞在 2.5 pg/mL 的 5(6)-FITC 中重懸，在 4℃ 下染色 45min。
(3) 上機(jī)：用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)綠色熒光的比例。
5(6)-FITC 用于蛋白酶測(cè)定^[2]
(1) 將 1 g 酪蛋白溶解在 100 mL 的溶液中，該溶液含有 50 mM 碳酸鈣和 150 mM 氯化鈉，pH值為 9.5?？梢韵葘⑷芤杭訜嶂练序v，然后冷卻至室溫。
(2) 加入 40 mg 5(6)-FITC，室溫下輕輕攪拌 1 h。
(3) 通過(guò)透析去除游離的 5(6)-FITC，首先在 4°C 下用 2 L 含活性炭的水透析，然后用 pH 8.5 的 50 Mm Tris 緩沖液透析，最后用 pH 7.2 的 50 mM Tris 緩沖液透析。
(4) 使用 pH 7.2 的 50 mM Tris 緩沖液將蛋白質(zhì)濃度調(diào)整為 0.5%。底物分裝成 5 mL 每份，冷凍保存在 -20°C，可穩(wěn)定保存 1 年。
(5) 通過(guò)測(cè)量底物在 490 nm 處的吸光度，使用 Lowry 法測(cè)量蛋白質(zhì)含量，確定每個(gè)酪蛋白分子上有 0.65 個(gè) FITC 殘基。
(6) 使用 FTC-酪蛋白進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)混合物包含 10 μL 酶、20 μL 測(cè)定緩沖液和 20 μL 0.5% 的 FITC-酪蛋白。
(7) 胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶：測(cè)定緩沖液為 pH 7.8 的 100 mMTris 緩沖液，含 10 mM CaCl2; 或 pH 7.8 的 100 mM 磷酸鹽緩沖液，含 150 mM NaCl。
(8) 枯草桿菌蛋白酶：測(cè)定緩沖液為 pH 7.6 的 20 mM 磷酸鹽緩沖液，含 150 mM NaCl。
(9) 熱穩(wěn)定性蛋白酶：測(cè)定緩沖液為 pH 7.8 的 100mM Tris 緩沖液，含 10 mM CaCl2。
(10) 彈性蛋白酶：測(cè)定緩沖液為 pH 8.8 的 20 mM 硼酸鹽緩沖液，含 150 mM NaCl。
(11) 充分混合后，將溶液在 37℃ 搖床水浴中孵育 5 min 至 24 h。孵育大于 3 h 可加入 0.2% 疊氮化鈉防止細(xì)菌生長(zhǎng)。
(12) 反應(yīng)通過(guò)加入 120μL 5% 三氯乙酸 (TCA) 并充分混合來(lái)終止。試管在室溫下靜置至少 1 小時(shí)。將試管回收并在 4°C 下過(guò)夜保存。通過(guò)離心 5 分鐘,沉淀 TCA 不溶性蛋白質(zhì)。取上清液 60 μL，用 pH 8.5 的 500 mM Tris 緩沖液稀釋至 400 μL 或 3 mL，并充分混合以確保整個(gè)樣品達(dá)到適當(dāng)?shù)?pH 值。
(13) 熒光測(cè)定使用激發(fā)波長(zhǎng) 365 nm 或 490 nm，發(fā)射波長(zhǎng) 525 nm。重復(fù)測(cè)量的平均值。使用單個(gè)值計(jì)算相關(guān)系數(shù) r 和回歸線(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)誤差 S。
(14) 胰蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶和熱穩(wěn)定性蛋白酶對(duì) FTC-酪蛋白的裂解與酶濃度呈線(xiàn)性關(guān)系。
免疫熒光檢測(cè)血小板上 FITC 標(biāo)記抗體^[3]
(1) 富血小板血漿 (PRP) 制備：將血液在 22°C 下以 180 × g 離心 8 分鐘，分離出富血小板血漿。
(2) 血小板收集: 將 PRP 在 22°C 下以 1800 × g 離心 10 分鐘，收集血小板。紅細(xì)胞和白細(xì)胞的污染少于 0.5%。
(3) 血小板洗滌: 用 PBS 在 22°C 下以 1800 × g 離心 10 分鐘洗滌血小板兩次，然后將血小板重懸于 PBS 中。
(4) 純化人 IgG: 人 IgG 通過(guò) DEAE 纖維素層析從正常人血清中純化。
(5) 使用 FITC 標(biāo)記的山羊抗人 IgG 抗體: 總蛋白濃度為 6.2 mg/mL，熒光素/蛋白摩爾比為 2.6，特異性抗體濃度為 1.6 mg/mL。
(6) 將 FITC 標(biāo)記的抗人 IgG 山羊抗體加入到含有 8.0 × 10⁸ 個(gè)細(xì)胞 /mL 的 0.5 mL 血小板懸浮液中，最終濃度為 1.0 × 10^-7M。在 22°C 下孵育 20 分鐘后，用 PBS 洗滌血小板兩次并重懸于 PBS 中。然后加入 SDS (1.5 mg/mL)，并通過(guò)熒光法測(cè)定結(jié)合的抗人 IgG 抗體，激發(fā)波長(zhǎng)為 493 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 516 nm。
5(6)-FITC 與 PAMAM G4 偶聯(lián)^[4]
(1) 將 30 μL (3 mg) 的 PAMAM-G4 樹(shù)狀大分子溶解在 10 wt% 的甲醇溶液中，加入到 250 μL 0.1 M 磷酸鹽緩沖液 (pH 8.5) 中。
(2) 將混合液與 1mg 5(6)-FITC 共同孵育，5(6)-FITC 溶于 60 μL 干燥的 DMSO 中，在室溫下孵育 1 小時(shí)。
(3) 偶聯(lián)了 FITC 的 PAMAM-G4 樹(shù)狀大分子通過(guò)凝膠過(guò)濾法使用含有 Sephadex G25 的 PD-10 脫鹽柱進(jìn)行純化。以 0.1 M 磷酸鹽緩沖液 (pH 8.5) 作為流動(dòng)相，收集 0.5 mL 的組分。
注意事項(xiàng)
1. 5(6)-FITC 對(duì)光及濕度敏感。即用即配 5(6)-FITC 溶液并丟棄未使用的部分。
2. 低濃度的疊氮化鈉 (≤3 mM 或 0.02％) 或硫柳汞 (≤0.02 mM 或 0.01％) 不會(huì)顯著干擾蛋白標(biāo)記; 但是 20-50％ 的甘油會(huì)降低標(biāo)記效率。
3. 避免使用含伯胺 (例如 Tris，甘氨酸) 或銨離子的緩沖液，它們與待標(biāo)記蛋白競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。
4. 本產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。
5. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

MCE has not independently confirmed the accuracy of these methods. They are for reference only.

389.38

C₂₁H₁₁NO₅S

27072-45-3

固體

Yellow to orange

525

488

Room temperature in continental US; may vary elsewhere.

• [1]. J S Miller , ET AL. Flow cytometric identification of microorganisms by dual staining with FITC and PI. Cytometry. 1990;11(6):667-75.  [Content Brief]

  [2]. S S Twining, et al. Fluorescein isothiocyanate-labeled casein assay for proteolytic enzymes.Anal Biochem. 1984 Nov 15;143(1):30-4.  [Content Brief]

  [3]. K Sugiura, et al. A simple quantitative immunofluorescence assay for FITC-labeled antibody on platelets. J Immunol Methods. 1981;40(2):165-70.  [Content Brief]

  [4]. Natalia Oddone, et al. Cell uptake mechanisms of PAMAM G4-FITC dendrimer in human myometrial cells. J Nanopart Res. 2013 15:1776.