Thiazole Orange is an asymmetric anthocyanin dye that can be coupled with oligonucleotides (ONs) to prepare fluorescent hybridization probes. Thiazole Orange has been widely used in biomolecular detection and staining of DNA/ RNA in gels and can be used for reticulocyte analysis. Thiazole orange generates a significant fluorescence enhancement and high quantum yield when it binds with nucleic acids, especially RNA. Thiazole orange can permeate living cell membranes. Thiazole orange can use UV light for detection, but can also be detected with blue light. The excitation and emission of Thiazole orange are λ_ex = 510 nm (488 nm and 470 nm also show strong excitation) and λ_em = 527 nm, respectively^{[1][2][3][4][5][6]}.

Thiazole Orange 染色液的配制：
1.1制備儲(chǔ)存液
1.1.1 用甲醇配制 1 mg/mL 的 Thiazole Orange。如用 1 mL 甲醇溶解 1 mg Thiazole Orange。
注：1) 將 Thiazole Orange 儲(chǔ)存液在含有 0.002 M EDTA 和 0.02% 疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖鹽水中以 1：10000 稀釋。稀釋的染料溶液在室溫下避光保存時(shí)可穩(wěn)定保存至少 1 周。
1.1.2 用 DMSO 配制 13 mg/mL 的 Thiazole Orange。如用 1 mL DMSO 溶解 13 mg Thiazole Orange。
注：1) 不使用時(shí)將 Thiazole Orange 存放在黑暗中。該溶液在室溫下可穩(wěn)定保存數(shù)月。
1.2工作液的配制
將 1 mg/mL 的 Thiazole Orange 儲(chǔ)存液在含有 0.002 M EDTA 和 0.02% 疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖鹽水中以 1：10000 稀釋。
Thiazole Orange 染色
1 網(wǎng)織紅細(xì)胞分析^[1]
1)將全血 (5 μL) 加入稀釋的染料溶液 (1 mL) 中，在 12 x 75 mm 的培養(yǎng)管中，在室溫下孵育 1 小時(shí)。樣本在 FACS IV，F(xiàn)ACS 440 或 FACStar 上進(jìn)行分析。
2）數(shù)據(jù)分析 (流式細(xì)胞術(shù))：成熟紅血球位于左側(cè)和中間標(biāo)記之間，網(wǎng)織紅細(xì)胞位于中間和右側(cè)標(biāo)記之間。細(xì)胞類型的分配是通過人外周單核細(xì)胞混合的全血分析確定的。
2 DNA 電泳^[3]
1) 在緩沖液中混合瓊脂糖 (約 1% w/v，具體百分比可根據(jù)所需的分離大小進(jìn)行調(diào)整) (大約 70 mL 用于迷你凝膠 (8 x 7 cm))。常用的緩沖液為 TAE (Tris-醋酸-EDTA，40 mM Tris，20 mM 醋酸，1 mM EDTA，pH 約為 8.6) 或 TBE (Tris-硼酸-EDTA，90 mM Tris，90 mM硼酸，2 mM EDTA，pH 約為 8.3)。
2) 添加 Thiazole Orange，最終濃度為 1.3 μg/mL。
注意：在電泳后也可以用 Thiazole Orange 染色凝膠。
3) 微波加熱瓊脂糖，緩沖液和 Thiazole Orange 的混合物以溶解瓊脂糖 (約 60 秒)。這個(gè)步驟通常被稱為“融化”。如果需要，可以緩慢旋轉(zhuǎn) (5 秒) 以幫助溶解。讓瓊脂糖溶液固化成凝膠。
4) 將凝膠放入電泳儀中。使用加載染料加載 DNA 樣本 (通常為 10 μL)。蓋上蓋子并連接電極。施加電壓 (通常為迷你凝膠時(shí)約100V)，直到加載染料移動(dòng)到適當(dāng)?shù)木嚯x (迷你凝膠約為 4-7 cm)。
注意：Thiazole Orange 帶有正電荷，移動(dòng)方向與電泳 DNA 相反。
5) 從電泳儀中取出凝膠，放在紫外線透視儀和藍(lán)光透視儀上 (最大發(fā)射波長(zhǎng)約為 470 nm)。
6) 在膠成像設(shè)備中選擇合適的激發(fā)和發(fā)射設(shè)置。Thiazole Orange 的激發(fā)和發(fā)射 (λ_ex,max = 510 nm (488 nm 和 470 nm 也顯示出強(qiáng)激發(fā)，此外在紫外線波長(zhǎng)下也有強(qiáng)激發(fā))；λ_em = 527 nm)。

MCE has not independently confirmed the accuracy of these methods. They are for reference only.

476.61

C₂₆H₂₄N₂O₃S₂

107091-89-4

固體

Pink to red

噻唑橙

Room temperature in continental US; may vary elsewhere.

• [1]. Linda G. Le, et al. Thiazole Orange: A New Dye for Reticulocyte Analysis. cytometry 7:508-517 (1986)

  [2]. Piotr Klimkowski, et al. Design of thiazole orange oligonucleotide probes for detection of DNA and RNA by fluorescence and duplex melting. Org Biomol Chem. 2019 Jun 28; 17(24): 5943–5950.  [Content Brief]

  [3]. O'Neil CS, et al. DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes. J Vis Exp. 2019 Mar 31;(145)  [Content Brief]

  [4]. Suss O, et al. Broad Applications of Thiazole Orange in Fluorescent Sensing of Biomolecules and Ions. Molecules. 2021 May 10;26(9):2828.  [Content Brief]

  [5]. Long W, et al. Molecular Recognition and Imaging of Human Telomeric G-Quadruplex DNA in Live Cells: A Systematic Advancement of Thiazole Orange Scaffold To Enhance Binding Specificity and Inhibition of Gene Expression. J Med Chem. 2021 Feb 25;64(4):2125-2138.  [Content Brief]

  [6]. Lu YJ, et al. Molecular Engineering of Thiazole Orange Dye: Change of Fluorescent Signaling from Universal to Specific upon Binding with Nucleic Acids in Bioassay. ACS Chem Biol. 2016 Apr 15;11(4):1019-29.  [Content Brief]