PD帕金森癥模型
PD帕金森癥模型 性質(zhì)
帕金森病(PD)是常見于中老年人群的神經(jīng)退行性疾病，患病率隨年齡增加逐步增高，大約有1%的60歲以上的人受到PD的影響，80歲以上人群患病率約為3%，相關(guān)研究數(shù)據(jù)顯示,我國PD患者高達(dá)1.7%，PD其他相關(guān)疾病的發(fā)病率也隨著年齡的增長而增加。
Parkinson's disease（PD）是神經(jīng)退行性疾病的一種，伴有認(rèn)知神經(jīng)以及自主神經(jīng)功能障礙，其主要病理學(xué)特征是中腦黑質(zhì)中多巴胺（DA）能神經(jīng)元的變性和死亡，殘存神經(jīng)元中路易小體（LB）的形成和α-突觸核蛋白的聚集也是帕金森病的典型特征之一。
中腦內(nèi)的黑質(zhì)（substantia nigra）呈半月形，位于中腦被蓋和大腦腳底之間，在新鮮標(biāo)本呈黑色而得名，黑質(zhì)致密部（SNpc）主要為多巴胺能神經(jīng)元，是腦內(nèi)合成多巴胺的主要核團(tuán)，發(fā)生病變時，多巴胺合成減少，是引起PD的主要病因。理想的帕金森病動物模型，應(yīng)具備以下特點：
(1)多巴胺能神經(jīng)元在出生時數(shù)量及形態(tài)正常，青年時期開始逐漸選擇性地減少，減少量超過50％，且容易通過神經(jīng)化學(xué)和神經(jīng)生理學(xué)的方法檢測到；
(2)模型應(yīng)能容易檢測其運動功能的損傷，包括運動遲緩、肌僵直和靜止性震顫等PD的主要癥狀；
(3)模型應(yīng)能顯示出路易小體的形成；
(4)如果模型是遺傳性的，應(yīng)基于單一突變而使突變模型有著強大的傳播能力；
(5)模型應(yīng)有相對較短的疾病周期(如數(shù)月)，以使藥物篩選得以經(jīng)濟(jì)、快速地進(jìn)行。PD動物模型中應(yīng)用的多巴胺能神經(jīng)毒素分子及其細(xì)胞內(nèi)途徑的示意圖如下：
MPTP(黑色囊泡)系統(tǒng)給藥后穿過血腦屏障進(jìn)入大腦，經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞攝取后被單胺氧化酶(MAO-B)氧化為MPP+(藍(lán)色囊泡)釋放到細(xì)胞間隙，再經(jīng)多巴胺轉(zhuǎn)運體(DAT)進(jìn)入到多巴胺能神經(jīng)元，作用于線粒體呼吸鏈復(fù)合酶I；6-OHDA直接注射到大腦，經(jīng)多巴胺轉(zhuǎn)運體(DAT)進(jìn)入到多巴胺能神經(jīng)元，作用于線粒體呼吸鏈復(fù)合酶I。
1. 動物
SPF級C57BL/6健康小鼠，50只，雄性，8周齡，體質(zhì)量（25±2）g，小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由進(jìn)食、飲水，室溫（23±2）℃，相對濕度（55±10）%，光照、黑夜12h循環(huán)，小鼠自由飲水、飲食。
2. 分組與造模
50只C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機選取10只作為正常組，其余40只小鼠采用MPTP腹腔注射法制PD模型。
造模方法：將MPTP溶于無菌生理鹽水中，按25mg/kg劑量腹腔注射，并聯(lián)合使用丙磺舒（250mg/kg）延緩MPTP代謝清除，每周2次，連續(xù)5周，總計注射10次。非造模動物給予等體積0.9%NaCl溶液灌胃處理，持續(xù)5周。
模型復(fù)制成功后，采用隨機數(shù)字表將40只小鼠分成模型組、六味地黃湯組、金匱腎氣湯組、芪脊舒僵湯組。
因MPTP注射后小鼠僵直癥狀在數(shù)小時后逐漸恢復(fù)正常，為了研究中藥方劑對帕金森病小鼠僵直癥狀的影響，因此在中藥干預(yù)兩周結(jié)束后的第1d，采用15mg/kg的小劑量MPTP對小鼠進(jìn)行腹腔注射，以誘發(fā)僵直癥狀的出現(xiàn)。
3. 干預(yù)方法
六味地黃湯、金匱腎氣湯的組成與劑量均按照《方劑學(xué)》進(jìn)行配伍。按照人與動物千克體質(zhì)量折算的等效劑量換算方法換算小鼠每日灌胃劑量，按照換算藥物劑量的6倍，計算3種藥物灌胃劑量，分別為：芪脊舒僵湯：153.12g·（kg·d）-1、六味地黃湯：67.58g·（kg·d）-1、金匱腎氣湯：73g·（kg·d）-1，按照小鼠體質(zhì)量計算灌胃劑量，同時正常組與模型組均予以0.9%NaCl溶液灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃2周。
4. 模型評價與檢測
行為學(xué)檢測：爬桿實驗、僵直評分測試；
ELISA 法檢測各組小鼠目標(biāo)蛋白含量；
WB檢測TH蛋白表達(dá)水平；
免疫組化：小鼠黑質(zhì)層面陽性 TH+多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞。魚滕酮是一種天然有機殺蟲劑，具有親脂性，可透過血腦屏障，具有細(xì)胞毒性，并且是一種線粒體復(fù)合物Ⅰ的高親和力的特異性抑制劑，通過促進(jìn)線粒體活性氧的產(chǎn)生來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也可用于誘導(dǎo)自發(fā)性帕金森?。≒D）。動物：選8-10周齡的雄性Lewis大鼠，體重為300~350g，飼養(yǎng)：與MPTP誘導(dǎo)的模型相同，動物訂購之后需要至少適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后再進(jìn)行造模手術(shù)。
造模方式：大鼠用水合氯醛(350~400mg/kg)或戊巴比妥鈉(50～60mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉后，剃除背部毛發(fā)，局部皮膚消毒，將滲透微泵埋入背部皮下。每日（2~3mg/kg）的劑量灌注魚滕酮(V/V Ratio1：1；DMSO/PEG)，連續(xù)5周?？蛇x擇性引起黑質(zhì)－紋 體DA系統(tǒng)變性，在黑質(zhì)細(xì)胞內(nèi)有類似Lewy小體的α-syntrclein陽性包涵形成。行為學(xué)表征面運動減少，有時伴強直、震顫。
模型特點：與人類PD類似，該模型同時復(fù)制出PD多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中的包涵體和氧化應(yīng)激損傷，因此魚藤酮模型概括了PD發(fā)病中的多數(shù)重要機制。使用此模型進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)性藥物實驗比用其他急性的PD模型效果更好。缺點是制備過程費時、費力，雙側(cè)損傷的動物很難存活。
持續(xù)輸注魚藤酮導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體多巴胺日益減少
Parkinson's disease（PD）是神經(jīng)退行性疾病的一種，伴有認(rèn)知神經(jīng)以及自主神經(jīng)功能障礙，其主要病理學(xué)特征是中腦黑質(zhì)中多巴胺（DA）能神經(jīng)元的變性和死亡，殘存神經(jīng)元中路易小體（LB）的形成和α-突觸核蛋白的聚集也是帕金森病的典型特征之一。
中腦內(nèi)的黑質(zhì)（substantia nigra）呈半月形，位于中腦被蓋和大腦腳底之間，在新鮮標(biāo)本呈黑色而得名，黑質(zhì)致密部（SNpc）主要為多巴胺能神經(jīng)元，是腦內(nèi)合成多巴胺的主要核團(tuán)，發(fā)生病變時，多巴胺合成減少，是引起PD的主要病因。理想的帕金森病動物模型，應(yīng)具備以下特點：
(1)多巴胺能神經(jīng)元在出生時數(shù)量及形態(tài)正常，青年時期開始逐漸選擇性地減少，減少量超過50％，且容易通過神經(jīng)化學(xué)和神經(jīng)生理學(xué)的方法檢測到；
(2)模型應(yīng)能容易檢測其運動功能的損傷，包括運動遲緩、肌僵直和靜止性震顫等PD的主要癥狀；
(3)模型應(yīng)能顯示出路易小體的形成；
(4)如果模型是遺傳性的，應(yīng)基于單一突變而使突變模型有著強大的傳播能力；
(5)模型應(yīng)有相對較短的疾病周期(如數(shù)月)，以使藥物篩選得以經(jīng)濟(jì)、快速地進(jìn)行。PD動物模型中應(yīng)用的多巴胺能神經(jīng)毒素分子及其細(xì)胞內(nèi)途徑的示意圖如下：
MPTP(黑色囊泡)系統(tǒng)給藥后穿過血腦屏障進(jìn)入大腦，經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞攝取后被單胺氧化酶(MAO-B)氧化為MPP+(藍(lán)色囊泡)釋放到細(xì)胞間隙，再經(jīng)多巴胺轉(zhuǎn)運體(DAT)進(jìn)入到多巴胺能神經(jīng)元，作用于線粒體呼吸鏈復(fù)合酶I；6-OHDA直接注射到大腦，經(jīng)多巴胺轉(zhuǎn)運體(DAT)進(jìn)入到多巴胺能神經(jīng)元，作用于線粒體呼吸鏈復(fù)合酶I。
1. 動物
SPF級C57BL/6健康小鼠，50只，雄性，8周齡，體質(zhì)量（25±2）g，小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由進(jìn)食、飲水，室溫（23±2）℃，相對濕度（55±10）%，光照、黑夜12h循環(huán)，小鼠自由飲水、飲食。
2. 分組與造模
50只C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機選取10只作為正常組，其余40只小鼠采用MPTP腹腔注射法制PD模型。
造模方法：將MPTP溶于無菌生理鹽水中，按25mg/kg劑量腹腔注射，并聯(lián)合使用丙磺舒（250mg/kg）延緩MPTP代謝清除，每周2次，連續(xù)5周，總計注射10次。非造模動物給予等體積0.9%NaCl溶液灌胃處理，持續(xù)5周。
模型復(fù)制成功后，采用隨機數(shù)字表將40只小鼠分成模型組、六味地黃湯組、金匱腎氣湯組、芪脊舒僵湯組。
因MPTP注射后小鼠僵直癥狀在數(shù)小時后逐漸恢復(fù)正常，為了研究中藥方劑對帕金森病小鼠僵直癥狀的影響，因此在中藥干預(yù)兩周結(jié)束后的第1d，采用15mg/kg的小劑量MPTP對小鼠進(jìn)行腹腔注射，以誘發(fā)僵直癥狀的出現(xiàn)。
3. 干預(yù)方法
六味地黃湯、金匱腎氣湯的組成與劑量均按照《方劑學(xué)》進(jìn)行配伍。按照人與動物千克體質(zhì)量折算的等效劑量換算方法換算小鼠每日灌胃劑量，按照換算藥物劑量的6倍，計算3種藥物灌胃劑量，分別為：芪脊舒僵湯：153.12g·（kg·d）-1、六味地黃湯：67.58g·（kg·d）-1、金匱腎氣湯：73g·（kg·d）-1，按照小鼠體質(zhì)量計算灌胃劑量，同時正常組與模型組均予以0.9%NaCl溶液灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃2周。
4. 模型評價與檢測
行為學(xué)檢測：爬桿實驗、僵直評分測試；
ELISA 法檢測各組小鼠目標(biāo)蛋白含量；
WB檢測TH蛋白表達(dá)水平；
免疫組化：小鼠黑質(zhì)層面陽性 TH+多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞。魚滕酮是一種天然有機殺蟲劑，具有親脂性，可透過血腦屏障，具有細(xì)胞毒性，并且是一種線粒體復(fù)合物Ⅰ的高親和力的特異性抑制劑，通過促進(jìn)線粒體活性氧的產(chǎn)生來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也可用于誘導(dǎo)自發(fā)性帕金森?。≒D）。動物：選8-10周齡的雄性Lewis大鼠，體重為300~350g，飼養(yǎng)：與MPTP誘導(dǎo)的模型相同，動物訂購之后需要至少適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后再進(jìn)行造模手術(shù)。
造模方式：大鼠用水合氯醛(350~400mg/kg)或戊巴比妥鈉(50～60mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉后，剃除背部毛發(fā)，局部皮膚消毒，將滲透微泵埋入背部皮下。每日（2~3mg/kg）的劑量灌注魚滕酮(V/V Ratio1：1；DMSO/PEG)，連續(xù)5周?？蛇x擇性引起黑質(zhì)－紋 體DA系統(tǒng)變性，在黑質(zhì)細(xì)胞內(nèi)有類似Lewy小體的α-syntrclein陽性包涵形成。行為學(xué)表征面運動減少，有時伴強直、震顫。
模型特點：與人類PD類似，該模型同時復(fù)制出PD多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中的包涵體和氧化應(yīng)激損傷，因此魚藤酮模型概括了PD發(fā)病中的多數(shù)重要機制。使用此模型進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)性藥物實驗比用其他急性的PD模型效果更好。缺點是制備過程費時、費力，雙側(cè)損傷的動物很難存活。
持續(xù)輸注魚藤酮導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體多巴胺日益減少