背景^[1-3]

MDA-MB-436是一種人乳腺癌細(xì)胞系，源于一名43歲患有乳腺腺癌的女性的胸腔積液。這種細(xì)胞系呈現(xiàn)多形性，并且在間接免疫熒光染色時(shí)與抗微管抗體呈現(xiàn)強(qiáng)烈反應(yīng)。MDA-MB-436細(xì)胞系被推薦使用Leibovitz's L-15培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，這種培養(yǎng)基不能通入二氧化碳，因?yàn)槎趸紩?huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性。

MDA-MB-436(人乳腺癌細(xì)胞)細(xì)胞系屬于三陰性乳腺癌細(xì)胞系，這意味著其激素受體、孕激素受體和HER2均為陰性，因此對(duì)內(nèi)分泌治療和HER2靶向治療無效。這使得三陰性乳腺癌具有高侵襲性和低存活率，晚期主要依靠化療來緩解。

在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，MDA-MB-436(人乳腺癌細(xì)胞)細(xì)胞系被廣泛用于乳腺癌的研究，包括發(fā)病機(jī)制、藥物篩選以及治療方法的研究。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室需要滿足一定的要求，包括無菌環(huán)境和必要的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備。

MDA-MB-436(人乳腺癌細(xì)胞)

MDA-MB-436(人乳腺癌細(xì)胞)培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇MDA-MB-436(人乳腺癌細(xì)胞)：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)MDA-MB-436(人乳腺癌細(xì)胞)傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)MDA-MB-436(人乳腺癌細(xì)胞)凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

MDA-MB-436(人乳腺癌細(xì)胞)可以用于乳腺癌驅(qū)動(dòng)基因的篩選及丹參酮ⅡA對(duì)驅(qū)動(dòng)基因影響的初步探索

研究首先使用自發(fā)性乳腺癌小鼠模型MMTV-PyMT,通過灌胃給予不同劑量(30mg·kg-1和60mg·kg-1)的丹參酮ⅡA,證實(shí)了60mg·kg-1丹參酮ⅡA可以顯著抑制乳腺由腺瘤向早期癌的惡變;其次利用靜息態(tài)乳腺癌細(xì)胞模型MDA-MB-436(人乳腺癌細(xì)胞),丹參酮ⅡA給藥處理24小時(shí)后,EdU增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)了丹參酮ⅡA體外可以抑制MDA-MB-436(人乳腺癌細(xì)胞)細(xì)胞的增殖能力;此外,我們使用Q-TRAP 4500型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)了給藥30分鐘、1小時(shí)和2小時(shí)后的MMTV-PyMT小鼠乳腺組織和血漿中丹參酮ⅡA及其代謝產(chǎn)物丹參酮ⅡB和紫丹參甲素A的含量,結(jié)果表明乳腺組織中丹參酮ⅡA及其代謝產(chǎn)物的濃度低于血漿中含量,且在1小時(shí)左右濃度達(dá)到峰值,說明丹參酮ⅡA多數(shù)通過消化道吸收入血后,進(jìn)入血液循環(huán)發(fā)揮藥效,到達(dá)靶器官的藥物較少。

收獲了MMTV-PyMT小鼠乳腺增生、腺瘤、早期癌和晚期癌階段的組織,其中腺瘤階段的病變區(qū)域使用激光捕獲顯微切割(Laser capture microdissection,LCM)進(jìn)行收集。Illumina HiSeq PE150全外顯子測(cè)序,測(cè)序數(shù)據(jù)過濾后對(duì)變異信息進(jìn)行挖掘。根據(jù)測(cè)序結(jié)果篩選出各個(gè)階段的單核苷酸突變、拷貝數(shù)變異和插入缺失突變;基于拷貝數(shù)增加、單核苷酸突變(stopgain和frameshift)篩選出不同階段的候選驅(qū)動(dòng)基因,使用一代Sanger測(cè)序和qPCR對(duì)候選驅(qū)動(dòng)基因進(jìn)行驗(yàn)證,初步篩選出mid1和pitx1兩個(gè)驅(qū)動(dòng)乳腺由腺瘤惡變?yōu)樵缙诎╇A段的關(guān)鍵基因。最后通過qPCR檢測(cè)第一部分乳腺組織中候選驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可以影響pitx1的表達(dá)。

[結(jié)論與意義]丹參酮ⅡA體外可以顯著抑制人源乳腺癌休眠細(xì)胞MDA-MB-436(人乳腺癌細(xì)胞)的增殖,體內(nèi)可以延緩MMTV-PyMT小鼠乳腺腺瘤向早期癌的惡變。通過對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展不同階段的組織進(jìn)行外顯子測(cè)序,篩選出候選驅(qū)動(dòng)基因。

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