背景^[1-3]

三叉奧斯特線蟲(chóng)PCR試劑盒是一種用于快速靈敏檢測(cè)三叉奧斯特線蟲(chóng)的試劑盒，基于PCR原理開(kāi)發(fā)而成。該試劑盒具有以下特點(diǎn)：

高特異性：與其他病毒無(wú)交叉反應(yīng)，無(wú)非特異性擴(kuò)增。

高靈敏度：檢測(cè)靈敏度可達(dá)10~100拷貝。

三叉奧斯特線蟲(chóng)PCR試劑盒操作簡(jiǎn)便：該系列所有試劑均采用相同的體系和條件，產(chǎn)品僅用于科研可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)檢測(cè)。

高通量：多種雙重PCR檢測(cè)以及三重PCR檢測(cè)試劑盒。

三叉奧斯特線蟲(chóng)PCR試劑盒使用時(shí)，用戶只需提供DNA模板，將試劑盒與模板、引物和水混合后進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取部分產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢查即可觀察到擴(kuò)增結(jié)果。此外，還有探針?lè)晒舛縋CR試劑盒可用于對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。

需要注意的是，使用PCR反應(yīng)液時(shí)需在冰中配置，以保持其穩(wěn)定性。同時(shí)，為了確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，建議在多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)后取平均值作為最終結(jié)果。

三叉奧斯特線蟲(chóng)PCR試劑盒

三叉奧斯特線蟲(chóng)PCR試劑盒的操作步驟如下：

1.樣本采集：從患者體內(nèi)采集血液、糞便、組織等樣本，并將其保存在無(wú)菌容器中。

2.DNA提?。簩⒉杉降臉颖具M(jìn)行DNA提取，通常采用柱式或磁珠式DNA提取試劑盒。提取后的DNA應(yīng)保存在-20°C或更低的溫度下。

3.PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)備：根據(jù)三叉奧斯特線蟲(chóng)PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求，配制PCR反應(yīng)體系，包括引物、熒光探針、dNTPs、DNA聚合酶等。

4.PCR反應(yīng)：將提取的DNA加入到PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件和時(shí)間根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行設(shè)置。

5.結(jié)果分析：將PCR反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)，根據(jù)熒光信號(hào)的出現(xiàn)情況判斷是否存在三叉奧斯特線蟲(chóng)的感染。

應(yīng)用^[4][5]

三叉奧斯特線蟲(chóng)PCR試劑盒可以用于奧氏奧斯特線蟲(chóng)檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用及其巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制因子功能鑒定

針對(duì)奧氏奧斯特線蟲(chóng)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制因子同系物進(jìn)行研究。通過(guò)比對(duì)分析得出，OoMIF與Teladorsagia circumcincta MIF(TciMIF)雖然沒(méi)有相同的核苷酸序列，但其氨基酸的同源性達(dá)到了l00%，說(shuō)明OoMIF和TciMIF是完全相同的蛋白。本研究通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)OoMIF和OoMIF的突變體，該突變體將第二位的脯氨酸突變?yōu)楦拾彼帷?/p>

三叉奧斯特線蟲(chóng)PCR試劑盒結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)重組的OoMIF和OoMIF的突變體均不具備氧化還原酶活性，但OoMIF展現(xiàn)出很好的互變異構(gòu)酶活性，其活性單位為105μmol/min/mg，ISO-1抑制試驗(yàn)證明，人類(lèi)的MIF的抑制劑不能夠完全抑制OoMIF的互變異構(gòu)酶活性。OoMIF具有一定的抑制單核細(xì)胞移動(dòng)作用但不是非常的明顯，能夠與人類(lèi)MIF競(jìng)爭(zhēng)與受體CD74結(jié)合且能后被巨噬細(xì)胞攝入胞內(nèi)。L3和L4階段線蟲(chóng)的OoMIF含量很高，且主要位于分泌蛋白和排泄物抗原中。本研究也證明OoMIF能夠促進(jìn)牛PBMC和U937細(xì)胞分泌IL-8and TNFа細(xì)胞因子。證明OoMIF在線蟲(chóng)感染牛的過(guò)程中，很可能在調(diào)節(jié)宿主的免疫系統(tǒng)起到一定的作用。

本研究為建立簡(jiǎn)單、便捷、快速的PCR檢測(cè)方法對(duì)奧氏奧斯特線蟲(chóng)進(jìn)行鑒別診斷，以GenBank公布的Ostertagia ostertagi間隔區(qū)ITS-2(登錄號(hào)為AB245023.2)為靶基因，利用分子生物學(xué)軟件Primer Primier5.0設(shè)計(jì)一對(duì)特異性PCR引物，通過(guò)三叉奧斯特線蟲(chóng)PCR試劑盒對(duì)PCR反應(yīng)體系中的Mg2+濃度、dNTP添加量、引物濃度、Taq酶添加量及退火溫度分別進(jìn)行優(yōu)化，以確定PCR的最佳反應(yīng)條件，結(jié)果證明其適宜反應(yīng)濃度為：3mM Mg2+，0.25mM dNTP，0.5μM引物濃度,0.5μL Taq酶(5U/μL)，其擴(kuò)增最適退火溫度為57°C。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果證明其與GenBank公布的ITS-2序列的同源性達(dá)100%，從而證實(shí)三叉奧斯特線蟲(chóng)PCR試劑盒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確為目的擴(kuò)增產(chǎn)物。本研究同時(shí)建立了簡(jiǎn)單、便捷、快速的熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)奧氏奧斯特線蟲(chóng)進(jìn)行鑒別診斷，以O(shè)stertagia ostertagi ITS-2為靶基因,建立檢測(cè)奧氏奧斯特線蟲(chóng)的熒光定量PCR檢測(cè)方法。

通過(guò)分子生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性熒光定量PCR引物,通過(guò)優(yōu)化三叉奧斯特線蟲(chóng)PCR試劑盒反應(yīng)條件，并對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性、敏感性、可靠性的檢測(cè)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為：Y=－3.425x+39.79，曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.998，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明SYBR Green I熒光定量PCR能檢測(cè)蟲(chóng)卵的最低濃度為1×103拷貝/μL,而普通PCR能檢測(cè)的最低模板濃度為1×105拷貝/μL。表明該方法檢測(cè)蟲(chóng)卵ITS-2的靈敏度是普通PCR的100倍。

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