什么是熒光素酶

熒火蟲熒光素酶(Firefly Luciferase)和海腎熒光素酶(Rellina Luciferase)組成雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炏到y(tǒng)（Dual-Luciferase Reporter Assay）。通過加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)過程中會發(fā)出生物熒光，然后可以通過化學(xué)發(fā)光儀測定反應(yīng)過程中釋放的生物熒光，從而比較不同組間基因表達(dá)的差異。

下面給大家普及一下可能會遇到的問題：

1.在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中，為什么要經(jīng)常用抗生素篩選？

1.在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中，為什么要經(jīng)常用抗生素篩選？體外培養(yǎng)過程中，不篩選也可以，只要時間不是很長， 接種代數(shù)不要很多。到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)基因丟失的情況。但若接種的代數(shù)過多，建議用藥物篩選一段時間或從原始的細(xì)胞株培養(yǎng)以保證細(xì)胞發(fā)光的強度，中喬新舟的LUC 、GFP 、RFP及雙標(biāo)記都使用puro抗性篩選。

?2.底物熒光素(Luciferin）是如何進(jìn)入小鼠體內(nèi)的？需要多少？

熒光素是腹腔注射或尾部靜脈注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)的，約一分鐘就可以擴散到小鼠全身。常用方法是腹腔注射，擴散較慢，開始發(fā)光慢，持續(xù)發(fā)光長。若進(jìn)行熒光素靜脈注射，擴散快，開始發(fā)光快，但發(fā)光持續(xù)時間很短。大部分發(fā)表的文章中，熒光素的濃度是150mg/kg 。20克的小鼠約需3mg的熒光素。

3.熒光素酶的發(fā)光特性如何？

通過腹腔注射老鼠后約一分鐘左右熒光素酶就開始發(fā)光，通常十分鐘后強度達(dá)到穩(wěn)定的最高點。在最高點通常持續(xù)約20-30分鐘后開始衰減，約三小時后發(fā)光全部消失。通常的檢測時間是在注射后15 - 35分鐘之間，但建議實驗人員在做不同實驗?zāi)Ｐ颓斑M(jìn)行連續(xù)時間點發(fā)光曲線的繪制，以確定最高穩(wěn)值的時間范圍。

4. 如何保證熒光素酶（Luciferase）的穩(wěn)定性？

熒光素酶基因是插到細(xì)胞染色體上的，當(dāng)細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時, 熒光酶也會得到持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。

5. 標(biāo)記的腫瘤接種以后，會發(fā)生 Luciferase 的丟失嗎？

丟失的可能性及量非常小，不會影響實驗結(jié)果。有一些實驗報道的結(jié)果中，標(biāo)記的細(xì)胞在動物體內(nèi)存活幾年的時間還可以持續(xù)發(fā)光，說明 Luciferase 基因的標(biāo)記非常穩(wěn)定。

6. 可以用腫瘤塊而不是細(xì)胞接種嗎？

可以先用標(biāo)記的細(xì)胞在皮下接種，然后從皮下取出腫瘤塊進(jìn)行原位接種。

7. 標(biāo)記細(xì)胞與標(biāo)記基因所用的啟動子有何不同？

標(biāo)記細(xì)胞一般用在細(xì)胞內(nèi)能穩(wěn)定表達(dá)的啟動子, 顯示細(xì)胞的數(shù)目。標(biāo)記基因一般用此基因的啟動子，與此基因平行表達(dá), 顯示此基因的表達(dá)數(shù)目，啟動子是CMV。

8. 熒光素酶的表達(dá)高低與所用啟動子的活性有關(guān)嗎？

有關(guān)，啟動子的活性高，則熒光素酶的表達(dá)高，啟動子的活性低，則熒光素酶的表達(dá)低。

9. 常用的熒光素酶？特性如何？

熒光素酶，Luciferase 和 Renilla 熒光素酶，二者的底物不一樣，前者的底物是 D-luciferin，后者的底物是 coelentarizine 。二者的發(fā)光顏色不一樣，前者所發(fā)的光波長在 540-600nm，后者所發(fā)的光波長在 460-540nm 左右。前者所發(fā)的光更容易透過組織，后者在體內(nèi)的代謝比前者快。大部分的發(fā)表文章通常使用前者用作報告基因， 也有一些文章使用兩者進(jìn)行雙標(biāo)記。

10.  組織切片可以觀察到生物發(fā)光嗎？

可以，但熒光酶的體外活性保持時間比較短， 約幾十分鐘。有相關(guān)的文獻(xiàn)。