概述^[1]

生物發(fā)光(Bioluminescence)是在自然界廣泛存在的、有生命的生物產(chǎn)生的一種發(fā)光現(xiàn)象.發(fā)光的生物種類很多，包括發(fā)光細(xì)菌、發(fā)光螢火蟲(chóng)、發(fā)光魚(yú)、發(fā)光海星、發(fā)光甲蟲(chóng)等.而能催化熒光素或脂肪醛氧化產(chǎn)生生物發(fā)光的一類酶即為熒光素酶(Luciferase)。從20世紀(jì)50年代就已經(jīng)開(kāi)始了對(duì)熒光素酶的研究。從1986年個(gè)成功地獲得表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素酶基因(luc基因)的轉(zhuǎn)基因煙草以來(lái)，熒光素酶的應(yīng)用和發(fā)展進(jìn)入了一個(gè)嶄新的時(shí)代.應(yīng)用熒光素酶大大增加了生物發(fā)光免疫分析技術(shù)(BLIA)的靈敏度和應(yīng)用范圍，并且由于具有敏感性高，特異性好，反應(yīng)迅速，操作簡(jiǎn)單，應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，已成為醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)等研究領(lǐng)域中一種新的手段。

熒光素酶的種類^[2]

自然界中具有發(fā)光能力的生物種類很多，常見(jiàn)的主要有：發(fā)光蘑菇(Luminousmushrooms)、發(fā)光蚯蚓(Luminousearthworms、發(fā)光細(xì)菌(Luminousbacteria)、發(fā)光水母(Luminousjellyfish)、發(fā)光甲蟲(chóng)(Luminousbeetles，它們主要由螢火蟲(chóng)(fireflies)，叩頭蟲(chóng)(clickbeetles)和歐洲螢(glowworms)3大種類組成)。目前，除發(fā)光蘑菇和發(fā)光蚯蚓的發(fā)光機(jī)理尚不清楚外，其余生物的發(fā)光機(jī)理已研究得較為透徹，并使細(xì)菌熒光素酶(BacterialLuciferase簡(jiǎn)稱BL)和螢火蟲(chóng)熒光素酶(FireflyLuciferase簡(jiǎn)稱FL)形成商品酶用于分析檢測(cè)。

北美螢火蟲(chóng)(Photinuspyralis，日本螢火蟲(chóng)(Luciolacruciata)及東歐螢火蟲(chóng)(L.mingrelica)可產(chǎn)生FL。夏威夷弧菌(Vibrioharveyi)、費(fèi)氏弧菌(V.fischeri)、明亮發(fā)光桿菌(Photobacteriumphosphoreum)及鰒發(fā)光桿菌(P.leiognathi)等海洋發(fā)光細(xì)菌和發(fā)光致病桿菌(Xenorhabdusluminescens)、羽田希瓦氏菌(Alteromonashanedai)等陸生發(fā)光細(xì)菌可產(chǎn)生BL。

應(yīng)用^[3]

1.作為報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)

發(fā)光細(xì)菌所含的細(xì)菌熒光素酶基因(lux)表達(dá)的直接結(jié)果是產(chǎn)生生物發(fā)光，反應(yīng)非常迅速且易于檢測(cè)，因而被廣泛用于基因操作，作為標(biāo)記基因和報(bào)告基因來(lái)研究基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)、表達(dá)和調(diào)控.從20世紀(jì)80年代就開(kāi)始了把熒光素酶基因當(dāng)作報(bào)告基因的研究.把從哈氏弧菌中提取出來(lái)的熒光素酶基因(luxAB)插入兩個(gè)質(zhì)粒載體pFIT001和pPALE001中，然后結(jié)合到大豆根瘤的固氮酶的固氮基因D(nifD)和固氮基因H(nifH)的啟動(dòng)子上.通過(guò)宿主細(xì)胞是否發(fā)光確定轉(zhuǎn)導(dǎo)是否成功，并通過(guò)宿主細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度的高低來(lái)確定啟動(dòng)子對(duì)基因表達(dá)的影響大小。

2.用于RNA干擾研究

RNA干擾(RNAi)是一種高效的、特異的阻斷體內(nèi)特異基因表達(dá)的基因阻斷過(guò)程，它被雙鏈的干擾RNA所介導(dǎo).這種現(xiàn)象可以在植物、真菌、蠕蟲(chóng)、甲蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中觀察到.在研究中發(fā)現(xiàn)僅僅對(duì)于一個(gè)基因而設(shè)計(jì)的少量的小干擾RNA(smallingerferingRNA，siRNA)還可以降解在哺乳動(dòng)物中的同類的信使RNA (mRNA).但小干擾RNA的作用原理還未被完全了解。

3.研究蛋白質(zhì)之間作用

熒光素酶還可以用于研究蛋白質(zhì)磷酸化和蛋白質(zhì)之間的作用.2001年根據(jù)蛋白質(zhì)的剪切和誘導(dǎo)互補(bǔ)技術(shù)開(kāi)發(fā)出一種新的方法.他們研究了在已知的結(jié)合位點(diǎn)之間的胰島素誘導(dǎo)作用時(shí)，先依據(jù)蛋白質(zhì)剪接原理，把DnaE內(nèi)蛋白(DNA聚合酶Ⅲ的一個(gè)催化亞基)切成兩個(gè)碎片，并讓DnaE內(nèi)蛋白的N-末端和C-末端分別與蟲(chóng)熒光素酶的兩個(gè)碎片的N-末端和C-末端結(jié)合。然后把其中一個(gè)碎片和磷酸化的胰島素受體底物1(IRS-1)結(jié)合，另一個(gè)碎片結(jié)合磷脂酰肌醇酯3激酶(PI3K)的SH2區(qū)域.當(dāng)受到刺激后，觸發(fā)了胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，IRS-1和PI3K相遇，而同樣綁定在IRS-1上的蟲(chóng)熒光素酶碎片的N-末端和綁定在PI3K的蟲(chóng)熒光素酶的C-末端相遇，由于蛋白質(zhì)的剪接作用發(fā)生結(jié)合，重新聚合成完整的熒光素酶，反應(yīng)并發(fā)出熒光.對(duì)熒光進(jìn)行監(jiān)測(cè)從而對(duì)胰島素受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行研究。

4.在細(xì)胞分析中的應(yīng)用

由于在活性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，ATP水平被嚴(yán)格控制，一旦細(xì)胞死亡，ATP的合成停止，從而ATP水平急劇下降.ATP已經(jīng)被廣泛作為一個(gè)細(xì)胞外信使.把蟲(chóng)熒光素酶基因插入葉酸鹽受體形成一個(gè)嵌合蛋白，這個(gè)嵌合蛋白具有葉酸鹽受體的N-末端的引導(dǎo)序列和C-末端的糖基磷脂酰肌醇著點(diǎn)(GPIanchor)，被稱為質(zhì)膜熒光素酶(pmeLUC).pmeLUC被定向的集中在質(zhì)膜的外側(cè)面，對(duì)毫摩甚至微摩濃度的ATP都很敏感，但不對(duì)其他任何核苷酸敏感.把pmeLUC傳染進(jìn)入P2X7受體，用熒光的變化測(cè)定P2X7受體激動(dòng)劑ATP，進(jìn)而對(duì)表達(dá)P2X7受體的白血病細(xì)胞系HL60，U937等進(jìn)行研究.而且，還可以利用克隆的熒光素酶作為測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ATP濃度的探針，給ATP定量，進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)，細(xì)胞毒性篩選和細(xì)胞增殖研究.

5.微生物檢測(cè)

在正常條件下，發(fā)光細(xì)菌在450～490nm時(shí)發(fā)出藍(lán)綠色可見(jiàn)光.與被檢物(如污水等)接觸后，當(dāng)被檢物中具有抑制發(fā)光細(xì)菌的物質(zhì)達(dá)到一定濃度時(shí)，則發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度將發(fā)生改變，其變化的程度與抑制物的毒性大小有關(guān)，并與抑制物質(zhì)的濃度在一定范圍內(nèi)相關(guān)。

6.在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

由于熒光素酶所引導(dǎo)的免疫生物發(fā)光技術(shù)不僅具有靈敏度高、特異性好、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，而且對(duì)熒光素酶所測(cè)定的活體沒(méi)有任何毒性，這為它在醫(yī)學(xué)上廣泛的應(yīng)用開(kāi)辟了道路。

制備^[2]

作為FL生產(chǎn)原料的螢火蟲(chóng)，要依靠人工捕捉或養(yǎng)殖，受地域和季節(jié)性限制，且該生物生產(chǎn)周期長(zhǎng)、養(yǎng)殖成本高、提取的酶成分復(fù)雜，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們轉(zhuǎn)向用基因工程的方法進(jìn)行生產(chǎn)。1985年，deWet，J.R.等首次克隆了P.Pyralis的FL基因，并在大腸桿菌(Escherichiacoli)中表達(dá)，從中得到具有活性的FL。1986年，他們測(cè)定了FL基因的cDNA序列。隨后，各種發(fā)光甲蟲(chóng)的FL基因相繼克隆成功，并能在原核和真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。

取自P.Pyralis長(zhǎng)約1.8kb的cDNA基因在E.coli表達(dá)的產(chǎn)物是分子量為62kD，含550個(gè)氨基酸的多肽鏈，與自然提取得到的FL相比，具有同樣的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特性和發(fā)射波長(zhǎng)，在相同的反應(yīng)條件下酶的穩(wěn)定性亦無(wú)差異。螢火蟲(chóng)熒光素酶基因通過(guò)克隆在E.coli表達(dá)，轉(zhuǎn)化體在37℃、LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)后期收集菌體，用滲透壓法、凍融法提取細(xì)菌胞質(zhì)組分，經(jīng)均質(zhì)、離心，用凝膠排阻、離子交換色譜提取純酶，冷凍干燥保存。BL可從培養(yǎng)發(fā)光細(xì)菌直接提取得到，其制備方法與FL類似。從V.harveyi中提取的酶活可達(dá)1.8×1011LU/mg，為獲得特殊用途的BL，亦可通過(guò)誘變或基因克隆得到。各種發(fā)光細(xì)菌的基因克隆均有許多報(bào)道。

主要參考資料

[1] 科學(xué)技術(shù)社會(huì)辭典·生物

[2] 熒光素酶研究進(jìn)展

[3] 熒光素酶的分類、結(jié)構(gòu)與應(yīng)用